糖基磷脂酰肌醇转酰胺酶与肝癌

贺玲 综述 姚克铖 审校

根据流行病学调查显示，肝癌是世界第六大最常见的癌症，每年新发病例约84万人，每年约78.2万人死于肝癌，已成为全球第四大癌症死亡原因，其中男性的发病率及死亡率显著高于女性[1]。而在中国，肝癌是第四大常见恶性肿瘤，死亡率仅次于肺癌，位居第二[2]。目前乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)仍然是全球肝癌最重要的危险因素，随着新生儿疫苗的接种及对HBV和HCV慢性感染的有效治疗使它们的重要性逐渐下降，然而代谢综合征、非酒精性脂肪性肝病、过量饮酒及某些地区粮食作物黄曲霉毒素污染等肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的危险因素正在增加。由于肝细胞癌的发生发展是一个异常复杂的过程，从癌前病变到原发性肝细胞癌是由多种因素如病毒感染、基因突变或表达异常、蛋白表达或修饰异常、信号通路异常等综合作用的结果[3]。肝切除术是治愈肝细胞癌的主要方法，随着化疗方案的改进、新药的研发及支持治疗的进步，患者5年生存率明显上升，但仍有相当多的患者出现术后复发和转移。糖基磷脂酰肌醇转酰胺酶(Glycosylphosphatidylinositol transamidase，GPI-T)是一种在内质网中发现的膜结合的多亚基蛋白复合物，GPI-T包含五个亚基：PIGK、GAA1、PIGS、PIGT和PIGU，其中PIGK为催化亚基，GAA1、PIGT、PIGU可以形成一个与PIGS相关的核心复合体，这四个亚基可以稳定PIGK，触发GPI锚定反应，缺少任何一个亚基可导致PIGK不稳定，以此确保GPI的锚定仅由完全组装的复合物催化[4]。GPI-T识别附着在GPI锚定化修饰的蛋白羧基端的信号肽，在ω和ω后面一个氨基酸之间进行剪切，ω位上的氨基酸通过硫脂键与PIGK蛋白上的半胱氨酸结合，之后被核心糖结构上的桥连磷酸乙醇胺攻击，最终把蛋白质连接到GPI锚上。随着对GPI-T亚基越来越多的研究，发现它参与HCC的发生发展。

1 PIGK与HCC

PIGK为GPI-T的催化亚基，大小为47 kD，属于C13半胱氨酸蛋白酶家族，PIGK有一个指向内质网管腔侧的可溶结构域和一个单一的羧基端跨膜区域，可溶性结构域与半胱氨酸蛋白酶序列相似，对保守的组氨酸和半胱氨酸残基的分析表明，它含有全部或部分酶催化机制，组氨酸可使半胱氨酸脱质子，而半胱氨酸亲核性攻击ω和ω后面的一个氨基酸之间的酰胺键生成硫酯中间体，该中间体随后与GPI锚定物转化为新的酰胺，另外它还通过二硫键与PIGT结合[5]。研究表明PIGK参与乳腺癌和卵巢癌等肿瘤的方式为过表达，但有研究者通过免疫组化等研究发现它在所有类型的肝癌中均表现出显著的下调[6]，另外Santanu等[7]也通过对HCC患者和肝癌细胞系的研究发现PIGK在HCC中是低表达的，它通过怎样的机制参与了HCC的发生发展目前尚需进一步研究来证明，PIGK下调是HCC的原因还是结果目前不得而知。

2 GAA1与HCC

GPAA1是在GPI-T复合物中最早发现的亚基，大小为67 kD，研究表明GPAA1是单一的锌离子金属肽酶[8]，它由一个氨基端跨膜结构域、一个可溶的结构域、五个羧基端跨膜结构域组成，GPAA1与PIGK、PIGT、PIGS、PIGU相关，并对转酰胺酶活性至关重要，它通过最后一个跨膜螺旋的保守609蛋白识别并稳定多肽底物的羧基端信号序列。此外亦有假说支持GPAA1与GPI-T蛋白底物相互作用，因此GAA1可能包含部分活性位点并参与肽结合和识别[9]。GAA1早在90年代就被发现为可能致癌，与PIGK不同，GPAA1基因在HCC患者中是被扩增的，90%的HCC患者GPAA1蛋白上调，此外GPAA1表达升高与HCC细胞分化和预后呈正相关[10]。FOXC2的表达受GPAA1表达水平的调控[11]，HCC患者中的GPAA1水平的上调可导致FOXC2的水平上调，而目前已有较多证据表明FOXC2参与了肝癌的生长和侵袭，并可作为肝癌预后预测因子[12]。此外，GPAA1过表达可使表皮生长因子受体(EGFR)被募集到GPI-T复合物中[13]，而EGFR可促进HCC细胞的增殖和生长，并协助HCC细胞对化疗药物形成耐药[14-15]，因此GAA1参与了肝癌的发展。

3 PIGS与HCC

PIGS是GPI转酰胺酶复合物的一个亚基，大小为61 kD的蛋白，有两个跨膜区域，跨膜区域之间有一个大的可溶性结构域，催化预形成的GPI附着到含有羧基端GPI附着信号的蛋白质上，敲除PIGS基因可消除PIGK和原蛋白底物之间硫酯中间体的形成，它是PIGK和蛋白质底物之间形成硫酯中间体所必需的[5]。五个亚基中，目前对于PIGS与HCC的研究较少，现有证据表明它在甲状腺癌、乳腺癌中显著过表达，且与健康组织相比，在肝脏中扩增了40%，Jatin等[6]的研究从mRNA水平指出PIGS在HCC中的表达是上调的，因此它参与HCC的机制有待研究。

4 PIGT与HCC

PIGT是一个69 kD的蛋白，具有较大的氨基端亲水性区域和羧基端跨膜结构域，在转酰胺化过程中，PIGT对于GPAA1和蛋白质底物之间羰基中间体的形成是必不可少的，PIGT稳定了PIGK和GPAA1，当PIGT被敲除时，其他GPI-T亚基的表达水平降低，PIGT通过两个保守的半胱氨酸残基与PIGK形成功能相关的二硫键，使其成为唯一与催化亚基共价连接的亚基，对GPI-T的活性是很重要[5]。目前已有大量研究表明PIGT参与了人类多项肿瘤的发生，前文提到GPAA1在HCC患者中是过表达的，而过表达的GAA1可将EGFR募集到GPI-T复合物中，导致EGFR、PIGT和PIGU通过EGFR酪氨酸激酶磷酸化，PIGT的磷酸化可诱导paxillin磷酸化[13]，而paxillin通路的激活导致HCC细胞基质粘附并促进肝癌的转移。此外，PIGT的表达水平会使FOXC2转录因子的表达水平降低80%，而体外实验表明过表达PIGT可使FOXC2在mRNA和蛋白水平上增加[12]，而FOXC2参与了肝癌的生长和侵袭。

5 PIGU与HCC

PIGU是第五个被鉴定为GPI-T组成成分的亚基，它是一个高度疏水的38 kD蛋白，有8到10个跨膜区域，它的缺失会抑制细胞表面GPI锚定蛋白的形成。尽管PIGU在GPI-T复合物中的作用未知，但它与脂肪酸延长酶的弱序列相似性表明它可能参与了GPI锚定脂质部分的识别，它对GPI-T的稳定性至关重要，PIGU与PIGT、GAA1形成与PIGS相关的核心复合物，从而稳定PIGK，触发GPI锚定反应，同时PIGU是在人类癌症中发现的第一个GPI-T亚基[16]。研究表明PIGU的缺陷导致了智力残疾、癫痫、大脑异常[17]。

通过对肿瘤组织的癌症基因谱的RNA序列分析，发现PIGU在HCC中高表达[18]，进一步的实验数据证明PIGU蛋白在HCC组织中的表达比癌旁及正常肝组织明显增加，并证明肝癌组织中PIGU不论在RNA还是蛋白水平上都是GPI-T亚基中表达最显著的，PIGU表达水平越高，HCC患者的生存时间越短，同时结合PIGU表达水平和标准TNM分期系统的风险评分方法表明其在预测HCC患者5年生存率方面均优于TNM分期[19]，它可作为独立的预后预测因子。

对PIGU在HCC中的作用机制进行了深一步的研究，PIGU过表达可通过激活NF-κB通路活化STAT3，而STAT3在肝癌中是高表达的[20-21]，活化的STAT3与NF-κB形成复合物结合到端粒酶逆转录酶启动子区域促进癌细胞永生，活化的STAT3还可促进细胞因子(IL-6、IL-10)和生长因子(VEGF)的合成，这些细胞因子抑制树突状细胞(DC)的成熟并抑制它们刺激CD8+T细胞和自然杀伤细胞(NK)的抗肿瘤作用[20，22-23]，从而促进HCC进展。PIGU下调可降低NF-κB活性来下调侵袭相关分子MMP-2和MMP-9的表达[24]，抑制MMP-2和MMP-9可降低肝癌细胞的迁移和侵袭能力[25-27]，还可通过下调MMP-9抑制肝癌细胞的生长[28]。此外PIGU下调还可降低c-Myc蛋白水平，高水平的c-Myc蛋白可激活Yes相关蛋白-1(Yes-associated protein-1，YAP-1)从而激活未折叠蛋白应答反应(Unfold protein reaction，UPR)[29]，细胞通过UPR下游信号激活从而对肿瘤细胞产生保护作用，另外高水平的c-Myc蛋白可促进细胞增殖和细胞周期进展，缩短肝癌细胞的生长周期，促进肝癌细胞的生长[30-31]，因此，PIGU通过下调c-Myc蛋白抑制肿瘤的生长。PIGU下调还可直接增加肝癌细胞对NK-92细胞溶解的敏感性。

6 小结与展望

GPI-T作为GPI锚定蛋白合成过程中的关键酶，它的改变可导致GPI蛋白的结构和功能的重大改变，因此GPI-T是维持细胞正常功能必不可少的酶，长期炎症刺激激活一系列信号通路导致该酶或其不同亚基的表达水平的变化可能对肝细胞产生重大的生理影响，从而以新的方式解除对细胞生长的调控，因此是潜在的诊断及治疗的良好靶点。然而，目前对GPI-T亚基的研究仅大部分为肝癌组织与正常组织的表达差异上，其作用的分子机制及信号通路目前尚未完全明了，进一步的研究需明确各个亚基参与肝癌的具体机制，同时明确它是否影响GPI锚定蛋白的合成从而在血清中提供特异性的检测物，为GPI-T作为临床诊断提供依据，因此基于GPI-T作为临床免疫治疗还需要大量的基础实验来支持。