循环肿瘤DNA在肾癌中的研究进展

张璐 董振坤 综述 崔岩 审校

液体活检是以体液中的循环肿瘤细胞(CTCs)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环游离DNA(Circulating free DNA，cfDNA)、循环游离RNA(Circulating free RNA，cfRNA)或外泌体(Exosomes，Exs)为基础的新型检测技术，因为其可以作为监测泌尿生殖系统肿瘤患者疾病状态的潜在工具而备受关注。

ctDNA是存在于循环系统中来源于肿瘤的核酸片段，其主要来源于肿瘤细胞的坏死、凋亡以及外泌体分泌。ctDNA作为液体活检研究的热点，在肿瘤的诊断、疗效监测及个体化治疗方面均具有应用价值。与传统组织病理活检相比，进行ctDNA检测的优势在于创伤小、风险小，不仅可用于检测基因突变，还可以进行连续检测以监测疾病的复发和随着时间推移对治疗的反应。另外，检测ctDNA可获得肿瘤基因组信息，从病理学的角度来看，ctDNA更有可能代表整个肿瘤，减少传统组织活检异质性的问题，它还可以评估肿瘤基因表达的变化，并揭示耐药的潜在机制[1]。

肾细胞癌(RCC)是肾脏最常见的恶性肿瘤，约占成人恶性肿瘤的2%～3%，且发病率逐年上升[2]。VHL抑癌基因是肾癌最常见的突变基因，另外，还存在PBRM1、SETD2、BAP1、KDM5C、TSC1、TSC2和MTOR等突变[3]，其中MTOR突变通常是功能性激活的，这可能是具有MTOR突变的患者对mTOR通路抑制剂有效的原因[4]。而PBRM1、SETD2、BAP1及KDM5C突变与不良预后相关[5]。以无创方式检测这些基因改变，将改善肾细胞癌患者的临床治疗和生活质量。本文结合ctDNA在肾细胞癌有关的最新进展和面临的问题进行综述。

1 ctDNA在肾癌的检测方法

液体活检的基因组谱已被证明与相应肿瘤的基因组谱非常相似[6]。然而，肾癌的ctDNA检测与组织检测有相当大的不一致率，ctDNA检测技术的发展是解决ctDNA在肾癌中应用的关键问题。ctDNA检测方法在检测血浆中ctDNA时的灵敏度取决于使用的检测技术和平台，同时也取决于肿瘤分期、肿瘤异质性和肿瘤克隆性[7]。用于评估ctDNA的平台可检测不同数量的肾癌相关基因中不同类别的基因改变，包括单个核苷酸变体、插入突变、缺失突变和拷贝数扩增等。基因检测主要对DNA片段进行实时或数字PCR检测或高通量测序(Next generation sequencing，NGS)分析后，以识别基因改变、定量突变等位基因片段和基因拷贝数变异，不同的检测方法可能有不同的检测下限或不同的基因组区域。ctDNA检测主要应用于肾癌患者诊断和疾病的监测，特别是在肾癌的治疗和复查随访过程中，ctDNA发挥了其无创和可重复的优势。有研究通过应用RT-PCR检测肾细胞癌患者的ctDNA，发现当肾癌复发时ctDNA水平明显升高，这表明ctDNA是肾癌的潜在随访指标，定期检测ctDNA可以发现肾癌的进展[8]。另外，研究表明ctDNA浓度随分期增加而升高，在临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期恶性肿瘤患者中，ctDNA可检出的比例分别为47%、55%、69%和82%[9]，ctDNA与肾癌的分期也有相关性，通过对不同分期的肾癌进行ctDNA检测，相关研究发现转移性肾癌患者的ctDNA水平高于局限性肾癌患者，ctDNA在转移性肾癌中检出率也较高，因此ctDNA对肾癌分期具有价值。另外临床研究发现，当肿瘤治疗有效时，ctDNA水平会明显降低，因此ctDNA也可以作为肾癌治疗反应的生物标志物[10]。另外ctDNA在瘤种方面存在差异，超过75%的胰腺、膀胱、结肠、乳腺、肝、胃转移癌患者可检测到ctDNA，而在转移性肾细胞癌患者中检测到ctDNA要低于50%[9]。

2 ctDNA与肾癌组织检测的一致性

虽然ctDNA来源于肾肿瘤，但ctDNA检测和肾癌组织检测还存在不一致性，Hahn等[11]通过比较NGS在肾肿瘤组织和ctDNA中检测到的基因改变，发现肾肿瘤组织与ctDNA的基因改变数目无显著性差异，但两种检测结果符合率仅为8.6%。Chae等[12]在28例晚期实体肿瘤患者中也获得了类似的结果，在这两种途径检测到的突变中，超过50%的突变是使用另一种检测技术没有检测到的，这表明每种方法具有潜在的互补性。在Hahn等[11]研究中发现，19例转移性肾细胞癌(Metastatic renal cell carcinoma，mRCC)患者均在基于组织的NGS检测到基因突变，而在ctDNA的NGS分析中只有13例(68%)可以检测到基因突变，6例患者在ctDNA的NGS检测中未检出基因突变。这些阴性患者包括转移期检测不到ctDNA的患者、检测平台未覆盖的基因突变的患者或检测错误的样本等情况。此外，在两种检测途径中均检测到基因突变的患者中，只有5例具有与基于组织的NGS相同的突变，均为TP53和VHL基因的突变。其中VHL是肾细胞癌的一种截短突变，其突变在所有克隆中都是保守的，但是，VHL的符合率仅为50%。根据这些结果，在肾癌患者随访中仅通过一种基因特异性检测来监测疾病进展或复发的可能性很小。另外，需要不断改进ctDNA检测技术，提高ctDNA与肾癌组织检测的一致性。

3 ctDNA在肾癌的定性分析

肾癌转移的时间和部位很难预测，这给监测带来了很大的难度，及早发现转移性疾病可能会改善临床预后。ctDNA可作为根治术后局限性肾癌患者的一种潜在的监测标志物。在一项对30例行肾切除术的RCC患者的研究中，ctDNA的NGS被用来检测14个常见的突变基因，30例患者中有20例可检测到基因突变，包括非同义突变、移码突变、止损突变或剪接位点突变等。即使是疾病早期和肿瘤较小的患者也有可检测到的ctDNA突变[13]。这表明，即使是局限性肾细胞癌的肿瘤负荷较低，也会释放出可检测到的ctDNA，因此ctDNA定性分析很重要。Pal等[14]对220例mRCC患者的ctDNA进行了分析，79%的患者检测出基因突变，其中最常见的是TP53(35%)、VHL(23%)、EGFR(17%)、NF1(16%)和ARID1A(12%)，以单核苷酸变异体和小的插入或缺失突变为主。研究还比较了在一线舒尼替尼和帕唑帕尼治疗患者和二线纳武单抗、依维莫司、阿昔替尼和卡博替尼治疗患者的ctDNA分析中检测到的基因突变，研究发现，在随后接受二线治疗的晚期治疗组中，TP53(49%vs.24%，P=0.02)和NF1(20%vs.3%，P=0.01)的突变频率更高。这些研究结果表明某些基因突变可能是由于治疗的选择性压力而产生的，并可能在治疗耐药中发挥作用。

识别与肿瘤侵袭性相关的特定突变或一组突变，有助于应用液体活检指导mRCC的治疗，肾透明细胞癌与SETD2、PBRM1、BAP1、KDM5C、MTOR等基因突变有关[15]。散发乳头状1型肾细胞癌与met基因突变有关，而散发乳头状2型肾细胞癌则与CDKN2A、SETD2、NF2、CUL3、TERT突变有关[16]。另外，在已知的与治疗敏感性相关的分子通路中寻找特定的突变，有助于治疗的选择。依维莫司的敏感性与TSC1/TSC2/MTOR突变有关。在一项5例mRCC患者使用mTOR抑制剂治疗的研究中，Voss等[17]在TSC1和MTOR两个基因中发现了对mTOR信号有激活作用的基因突变，为治疗反应提供了合理的解释。TSC1和TSC2可能被筛选为VEGF靶向治疗进展的RCC患者对依维莫司反应的预测生物标志物，有助于二线靶向治疗药物的选择。

目前临床主要开展的肾癌ctDNA定性检测除了基因突变，还包括DNA甲基化异常。ctDNA的CpG岛甲基化在肾癌中普遍存在，可作为肾癌早期诊断的潜在生物标志物，APC基因的DNA超甲基化则与晚期肾癌分期有关[18]，已经在肾癌患者的ctDNA中检测到RASSF1A、FHIT和APC基因的CpG岛的甲基化，多基因甲基化联合分析的敏感度为62.9%，特异度为87.0%。此外，Jung等[19]检测了肾癌组织中SHOX2 mRNA的表达，以及循环游离DNA中SHOX2基因的甲基化，研究表明组织和血浆中SHOX2甲基化与肿瘤分期和术后死亡风险密切相关。

4 肾癌ctDNA与cfDNA检测的比较

cfDNA是指在体液(包括血液)中能检测到的由凋亡或坏死的细胞释放的不同长度的游离核酸片段，在健康人群的血液和肿瘤患者体内都可以检测到[20]。在急性钝性创伤、烧伤、脓毒症、心肌梗死和恶性肿瘤患者中均可检测到cfDNA水平升高[21-23]。而来源于肿瘤的ctDNA片段仅占总cfDNA的1.0%以下，从血浆中提取cfDNA及其定量方法并不能确定哪些DNA片段来自肿瘤细胞或来自坏死性炎症过程，因此特异性不高。cfDNA主要以浓度检测作定量分析，ctDNA主要以肿瘤基因特异性改变检测作定性分析。需要高灵敏的检测方法检测cfDNA中的微量ctDNA，PCR检测方法可以检测到样品中存在的单个靶分子，但不能检测出ctDNA中存在的多基因的突变和更大的结构变异。为此，高通量测序被用来测定cfDNA中肿瘤DNA。

cfDNA与ctDNA相比较诊断的特异性差，但cfDNA检测技术相对简单，通常仅需要进行定量分析，可以作为肾癌的监测指标。转移性肾透明细胞癌患者血浆cfDNA水平明显高于局限性肾透明细胞癌患者，cfDNA高的患者在肾癌根治术后的复发率明显高于血浆cfDNA低的患者(P=0.018)[8]。另外，血浆中cfDNA的定量可以预测索拉非尼治疗肾癌的疗效，在6个不同时间点采用实时定量PCR检测来分析mRCC患者接受索拉非尼治疗后cfDNA浓度，与进展期患者相比，缓解期或稳定期患者的cfDNA水平显著降低[24]。ctDNA与cfDNA在肾癌的疾病监测过程中具有互补性，cfDNA检测技术成熟且成本相对较低，可先行cfDNA的定量分析，当cfDNA升高后进一步行ctDNA定性检测，通过ctDNA分析进行指导治疗。另外，有研究发现肾癌患者ctDNA阳性时cfDNA高度片段化且小片段比例高，因此可以通过分析cfDNA的片段比例预测ctDNA，有效地指导ctDNA定性检测[25]。

虽然液体活检在临床上应用越来越广泛，但由于目前ctDNA检测方法的局限性，某些情况下不能从这种无创检测技术中获益，如肿瘤筛查和治疗后微小残留病灶的检测，尤其是区分cfDNA和ctDNA需要高灵敏度的技术和低成本的检测方法。为此，有学者基于免疫沉淀开发了一种新型敏感检测方法分析少量的cfDNA甲基化，研究发现，肿瘤特异性差异甲基化区域(DMRs)可以用一种低成本、高效率的方法检测，进而提高ctDNA检测的灵敏度[26]，这为ctDNA检测提供一个新的方向。

5 肾癌ctDNA与CTCs检测的比较

CTCs是指游离在血液循环中的从原发肿瘤或转移病灶脱落的肿瘤细胞。CTCs检测对于肾癌诊断、预后判断、预测治疗反应和监测肿瘤转移具有重要临床意义。游离核酸在循环中的半衰期为15分钟至数小时，比细胞及RNA更稳定，并且在技术上比CTCs更容易分离[27]。此外，ctDNA代表细胞池，可以让我们深入了解肿瘤基因改变的所有组成部分以及亚克隆的数量和性质。然而，在大多数情况下，ctDNA检测需要先了解目标靶标，并且不是所有的DNA突变都会表达出来。ctDNA必须从大量的野生型cfDNA中分离出来，与肿瘤患者相比，在健康人中也可检测到微量的cfDNA。作为监测治疗反应的生物标记物来说，目前还不清楚肿瘤细胞是由于治疗死亡或是对治疗耐药而形成ctDNA。细胞毒性化疗诱导白细胞和红细胞凋亡，导致cfDNA释放到血浆中，这也是一个潜在的干扰因素。另外，同样值得关注是CTCs可以是凋亡的，也可以是存活的，但只有存活的CTCs才会在肿瘤转移中起到重要的作用。

目前肾癌CTCs分离系统主要基于血细胞和肿瘤细胞之间的物理差异的方法和免疫细胞角蛋白表达，如上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)。细胞角蛋白的表达水平存在偏差，当肿瘤细胞如肾癌肉瘤样变发生上皮-间质转化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)时[28]，失去了细胞角蛋白的表达，导致部分或完全转变为间质表型，因此在CTCs分析中无法检测到。为了克服这种偏差，Ivonne等[29]开发了一种基于多参数免疫荧光显微镜的CTCs检测技术，该技术可以检测EpCAM等上皮标志物和具有间变和干细胞样属性的细胞。此外，针对肾细胞癌开发了一种替代CTCs检测抗原的新细胞表面标记物组合，由CA9和CD147组成，与传统的基于EpCAM的方法相比，其效率明显提高[30]。虽然ctDNA检测较CTCs有一定优势，但是对单细胞功能测定、代谢产物分析、蛋白质组学分析和RNA检测只能通过CTCs来实现[31-32]，因此ctDNA和CTCs具有一定的互补性。

6 小结与展望

循环肿瘤DNA检测是肾癌最具前景的无创检测技术。尽管通过肾癌组织活检和ctDNA检测都可以进行标志物的识别、预后的判断和分子亚型的分类，但跟踪克隆进化演变、早期识别耐药机制、监测治疗反应、监测复发和残留病变只有通过无创的ctDNA检测才可能实现。目前肾癌的ctDNA检测也面临许多问题和挑战，需要更深入的研究来推动临床应用。更好地了解ctDNA释放所涉及的机制，并采用综合的多维分析方法，将是解决这些问题的关键。