《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》解读

罗 越，胡洋洋，张 兴，王亚东，赵彩彦

(河北医科大学第三医院感染科，河北 石家庄 050051)

病原学诊断作为感染性疾病诊断最重要的环节之一，对感染性疾病精准诊疗的价值毋庸置疑，但传统的病原学检测技术存在检测周期长、阳性率低、受抗生素使用影响，特殊病原体难于检测等影响，不能满足当前临床快速、精准的病原学诊断，继而有的放矢的指导目标治疗的需求。宏基因组二代测序技术(metagenomics next generation sequencing,mNGS)简称二代测序，以其无偏倚、广覆盖、高通量、快速精准等优势，逐渐被临床所重视和认可。自2014年mNGS被首次用于脑脊液检测钩端螺旋体感染的病例后，国内外mNGS相关研究和文献报道越来越多，并逐渐在临床诊断实践中推广、普及。mNGS检测包括采集感染部位样本、提取核酸、制备文库，以及高通量测序、分析生物信息、解读检测报告等关键环节。作为一项新的生物检测技术，在临床应用过程中需要规范应用范围和诊断标准，优化检测流程与质量控制等环节，以最大限度提升其临床应用价值。《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》[1]，是针对感染病原体宏基因组学检测的第一部中国标准规范，于2020年11月由《中华传染病杂志》编辑委员会发布，重点总结mNGS检测技术在临床应用范围、样本采集规范、科学报告解读和诊断效能评估等方面，并制定推荐意见。笔者以临床角度从mNGS的适用范围与诊断效能、样本采集与运输质量控制、结果判读与验证等方面分别进行解读，以期加深临床医师对共识的认知和理解，全方位提升mNGS的临床应用与诊断效能。

1 mNGS检测的应用范围与诊断效能

传统病原学检测多建立在体外分离培养基础上，但由于体内外环境差异等因素干扰，致使部分致病病原微生物难以获取阳性结果。mNGS优势不仅在于能够发现传统方法无法检测到的病原体[2]，更重要的是能够在短时间内进行覆盖较大范围的病原体核酸检测[3-4]，因此对于临床可疑、疑难复杂感染或免疫抑制患者更具有重要临床价值，且由于检测技术的不断升级和完善，甚至可用于筛查病原体耐药突变信息及毒力基因[5]，协助抗生素的合理选择。因此对于临床疑似急危重症感染，或应用免疫抑制剂或存在免疫缺陷患者，在完善传统病原学检测同时，采集疑似感染部位样本进行mNGS检测。mNGS阴性结果同样有助于“排除”某些感染性疾病的诊断，以及不同病原体感染的甄别。因此共识推荐对于临床疑似感染以DNA为遗传物质的病原体(包括细菌、病毒、真菌或寄生虫等)行DNA检测，对于可疑RNA病毒感染时进行RNA检测。

1.1mNGS在临床疑似血流感染患者的应用与诊断效能 血流感染是指全身感染的患者血液培养呈阳性，可能是继发于原发部位明确的感染，或者来源未定。血流感染患者典型临床特点包括畏寒、寒战、发热和全身感染中毒症状，实验室检查提示外周血白细胞、中性粒细胞计数异常，红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)等炎症指标升高，部分实验室检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6等促炎症因子水平上升，如为细菌性感染，血清降钙素原水平升高具有更佳的敏感度和特异度。上述特点对临床疑似血流感染判定及评估mNGS检测必要性具有重要意义。根据不同划分标准，血流感染可以被分为不同类型，如单纯性和复杂性血流感染(包括导管相关血流感染、感染性心内膜炎等)。亦可分为原发性和局灶病变播散后的继发性血流感染。共识推荐：对于怀疑血流感染患者在留取血培养样本同时留存用于mNGS检测血样本。若血培养3 d未回报致病病原体，且抗感染经验治疗效果不佳，可送检标本进行mNGS检测。必要时可重新采样。对可疑继发性血流感染者，若由于原发感染灶无法采集适宜样本或病原学检测阴性，可考虑行血样本的mNGS检测。由于引发血流感染的病原体大部分是以DNA作为遗传物质的细菌、真菌、寄生虫、部分病毒，所以推荐血流感染患者首选DNA的mNGS检测，但在临床怀疑可能为病毒性肺炎、肾综合征出血热、登革热等RNA病毒感染时进行RNA测序。

血流感染方面，mNGS与血培养保持了高度的一致性，且具有更高的检测效能。当以血培养为金标准，mNGS检测敏感度和特异度分别为72.7%和89.6%，相比单纯血培养，联合mNGS检测阳性率升高近一倍(23.08%vs.12.82%)[6]。尤其在脓毒症休克患者，相比在起病时血培养33%阳性率，mNGS检测阳性率在起病3周内波动至71%左右[7]。因此mNGS可以作为传统病原学检测的重要补充手段。虽然mNGS检测对于血流感染具有快速、敏感等优势，且血液样本mNGS检测与血培养具有高度的吻合性，但由于血流感染的异质性较大，目前针对血流感染者尚缺乏大样本mNGS检测诊断效能研究。

1.2mNGS在临床疑似中枢神经系统感染患者的应用与诊断效能 中枢神经系统感染是一类以发热、头痛、脑膜刺激征、呕吐、抽搐、局灶性神经功能障碍、意识障碍等为特点的感染性疾病。行脑脊液检查可发现脑脊液浑浊，实验室检查白细胞和(或)中性粒细胞升高、蛋白质水平增加、脑脊液葡萄糖水平或脑脊液葡萄糖/血清葡萄糖比值降低等，影像学提示感染性改变是中枢神经系统感染性疾病的重要支持。某些特异性免疫检测及特殊染色，如隐球菌荚膜抗原检测与墨汁染色对隐球菌脑膜炎具有病原学诊断价值。因此对于可疑中枢神经系统感染患者，除留取脑脊液样本进行常规涂片、生化、培养及免疫相关指标检测外，同步留存脑脊液样本，若3 d内未明确感染病原体且抗感染经验性治疗无效，可送检留存脑脊液标本进行mNGS检测，必要时可重复腰椎穿刺术采集脑脊液样本。对于疑似中枢神经系统病毒感染，同样可以行脑脊液mNGS检测，尤其对于传统PCR检测方法未能明确感染病原体患者。对于慢性中枢神经系统感染患者，mNGS检测发现罕见、少见病原体的能力显著提高，因此可首选mNGS检测。

mNGS相比传统病原学检测在中枢神经系统感染诊断方面具有更高的敏感度、特异度和预测效能，通过对脑脊液和(或)脑组织检测，有助于发现多种致病细菌、真菌、病毒、寄生虫[8-9]，但在不同的疾病背景有所差异[10-11]。一篇对25篇论文44例经mNGS诊断疑似脑炎患者的Meta分析显示，除16例与传统PCR检测阳性结果一致，另外28例传统检测方法未能明确诊断的患者均被mNGS证实，提示mNGS对于新发或少见/罕见病原体感染诊断具有重要优势[4]。与传统培养技术相比，mNGS敏感度高达90%，且阳性率较培养提高近25%[12]。国内学者Guo等[9]通过对以细菌为主的中枢神经系统感染患儿研究显示，55.56%的mNGS结果与传统检测结果一致。虽然mNGS检测细菌、病毒、寄生虫的效果较好，且确实提升对多种新发及少见病原体的检出率，协助临床诊断疑难复杂感染病例，但在不同研究中其诊断率也仅0%～30%[13-17]，尤其对于真菌感染检测效能仍需更大样本量的临床试验来验证。另一方面，由于脑脊液病原体含量较低，对脑脊液上清液检测可能仅发现无细胞病毒或无细胞微生物核酸，明显降低检测的阳性率及临床指导价值，因此建议进行全脑脊液检测[4]。

1.3mNGS在临床疑似呼吸道感染患者的应用与诊断效能 呼吸道感染表现为以鼻塞、流涕、喷嚏、咽痛等为主要特点的上呼吸道感染，也可表现为以咳嗽、咳痰、咯血、气短、胸痛等为症状，查体示双肺不同程度干湿啰音和(或)肺实变体征为突出特点的下呼吸道感染，重者甚至可出现呼吸衰竭。实验室检查常可见血液白细胞和(或)中性粒细胞计数升高、炎症细胞因子升高；肺部影像学检查提示特征性炎症改变等。肺部感染病原学构成复杂，包括细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体等多种病原体。传统病原学检查以痰/支气管肺泡灌洗液涂片、染色和培养为主，针对特殊感染可辅助免疫学检测，或针对特定病原体核酸PCR检测。目前，对于呼吸道检测样本，由于mNGS检测成本较高，且其数据覆盖度相对固定和局限，因此其检测敏感度并不高于传统特异性PCR核酸测序。因此，推荐mNGS仅作为传统方法无法明确感染病原体的补充。3 d内传统病原学检测未发现病原体，且抗感染经验性治疗效果不佳，推荐送检呼吸道样本行mNGS检测。如存在病毒高发季节急性起病、血白细胞计数正常或偏低等高度怀疑病毒性肺炎征象，且病情进展快的患者，先完善呼吸道病毒多重PCR检测，若结果为阴性则再进行mNGS检测，并同时进行核酸RNA反转录检测。对于免疫抑制患者出现呼吸道感染或病情危重患者，在进行传统病原学检测同时，应尽快送检呼吸道样本行mNGS检测，以尽早明确罕见病原体或混合感染可能。

mNGS在肺部感染病原体诊断，尤其对于病毒、非典型病原体、混合感染等方面具有一定优势，利于发现常规检测无法鉴定的罕见病原体、病毒，并有助于多重感染鉴定[18-19]，但由于其无法有效区分呼吸道定植菌和病原菌，因此对于检测结果需要结合患者病情综合分析决策。虽然在针对厌氧菌、结核分枝杆菌、真菌、肺孢子菌等方面mNGS检测敏感度相比培养具有明显优势(50.7%vs.35.2%)，但mNGS对于结核分枝杆菌、布鲁菌等胞内菌，以及具有细胞壁的真菌的检测效能仍相对较低[19-21]。根据目前发表的多篇研究显示[22-25]，当应用mNGS技术进行呼吸道病原体检测时，在样本中病原微生物载量较高情况下，mNGS检测总体效能近似于PCR检测；但当样本中病原微生物载量较低时，其在敏感度方面不如PCR。因此，mNGS可作为传统病原学诊断的一种有效补充，两者联合应用可提高整体病原体的检出率。

1.4mNGS在临床疑似局灶性感染患者的应用与诊断效能 局灶性感染是一类以局部组织出现红、肿、热、痛、脓液渗出等为特征性表现的感染性疾病。皮肤软组织感染可形成脓肿；骨关节感染可伴随功能障碍；尿路感染可有尿频、尿急、尿痛等尿道刺激征；眼部感染可出现程度不同的畏光、流泪、视力下降、分泌物增多等。部分严重局灶性感染亦可伴有乏力、消瘦、消化道症状等非特异性表现，或伴随发热、畏寒、寒战，甚至休克等全身感染中毒症状。不同研究显示mNGS可提高皮肤软组织、骨关节、眼内、尿路、浆膜腔等局灶性感染的病原学检测能力[26-27]，对创伤弧菌、结核及非结核分枝杆菌等均有较强的诊断价值[28-29]，还可用于发现风疹病毒、阿米巴原虫、弓形虫、隐球菌等特殊感染的病原体[30-31]，甚至可用于尿路感染的耐药细菌检测[32]。

对于局灶组织感染甚至脓肿患者，mNGS对细菌检测的敏感度优于真菌，且总体敏感度和特异度均优于传统病原学及免疫学检测手段。针对骨关节感染患者，常规培养阴性的样本通过mNGS可额外发现49.3%～93.0%的致病病原体[33-34]。

2 mNGS样本处理质量控制要求与结果解读建议

2.1mNGS对样本采集、运输与处理的质量控制要求 mNGS检测样本根据可疑感染部位不同，包括组织样本、血液、脑脊液、胸腹部积液、浆膜腔液、肺泡灌洗液、痰液、咽拭子、分泌物及脓液等。检测所需样本量与测序要求及核酸数量级有关。为提高检测结果的阳性率和可信度，应根据患者的病情，进行选择与病灶最相关的样本类型送检。如可直接采集患者感染部位的组织或体液样本，并注明样本类型和采集部位。而对于感染部位样本采集困难、病情不能耐受有创操作，或暂无明确感染部位的患者，可选择患者血液样本进行送检，但检测结果的准确性和阳性率可能降低[35]。采集样本过程必须严格遵循无菌原则：对于无菌体液，应严格按照无菌操作采集样本，包括采集前的严格无菌消毒、采集后的无菌处理与运输，为避免污染，一般建议将采集的第2管样本送检。对于有菌部位的样本，同样需要无菌理念，避免混入正常菌群及定植菌，干扰后续检测结果的判读。采集后的样本应及时送检，送检过程中严格无菌原则，并遵守相应测序厂商的运输标准作业程序。需远距离运输的样本应采用冷链快速运输，并尽可能避免因反复冻融导致核酸不同程度降解，最终影响检验效能。如不能及时送检，应严格按照标准程序对样本进行储存。

2.2mNGS检测结果的临床判读与应用建议 mNGS检测流程质控体系虽然不在本文讨论范畴，但临床医师在解读报告过程仍需关注mNGS检测报告单中涉及到的实验内参照、阴性与阳性对照结果，以及相关质控标准，如测序深度、基因组覆盖度、检出病原体序列数、相对丰度等信息。

mNGS最大优势在于快速精准、高通量检测，为早期目标抗感染治疗提供证据支持，正确的解读同样是保证mNGS优势的关键。由于mNGS操作流程复杂，各个环节均易引入污染，干扰检测结果，且检出的病原体无法具体确定是定植菌、背景菌还是致病菌，因此对于测序结果为阳性的报告应根据患者临床特点、实验室及辅助检查结果系统分析、解读和验证[10]。对于呼吸道病毒感染，由于受测序数据覆盖度影响，相比反转录PCR，低覆盖度mNGS并不具备优势，但在明确病毒分型[22]，及缩短诊断时长方面具有一定优势[36]，因此可以辅助早期病原学诊断，指导抗感染药物选择，实现早期目标治疗、降低患者的病死率[23]。阳性结果固然有助于明确感染病原体，阴性结果亦可用于排除感染性疾病可能[17]。mNGS检测结果需与临床表现及其他辅助检查结果相结合作出解读，根据不同情况可分为以下几种类型：当mNGS检测结果与患者临床表现及相关实验室结果相符合，可根据结果指导临床抗感染决策。当患者mNGS检测结果阳性，且具有与之吻合的临床表现，但未获得其他实验室检查结果证据支持，可通过PCR方法验证，并进一步完善或重复传统病原学检测。若患者仅获得mNGS阳性检测结果，但与临床表现和(或)其他实验室检查结果不相符，不能仅根据mNGS检测结果进行病原学诊断，建议结合患者临床特点综合分析、鉴别各检查结果的准确度。对于mNGS检测结果阴性，而其他实验室检查结果为阳性(尤其是培养结果为阳性)，需结合患者临床表现及其他辅助检查综合分析，在必要情况下可考虑重复mNGS检测。

综上所述，mNGS已经逐步成为对临床感染性疾病精准诊断及抗感染目标治疗的一项有重要价值的检测技术。对新发的、疑难的感染病能够指明方向，进而帮助临床进行判断，并在病原学诊断、减少不必要抗生素使用等方面成为传统病原学检测的有效补充手段[3]。但mNGS的推广应用仍存在许多问题需要解决，包括检测成本较高、缺乏验证其可靠性和优越性的规范化大样本研究、缺乏统一的质控标准和规范的测序流程、致病原与背景菌鉴别困难、高质量的样本储存和运输条件要求等。共识并不推荐将mNGS作为临床轻症感染性疾病的一线检测手段。另外，由于目前耐药基因库尚未完全建立，mNGS对微生物耐药性的评价作用有限，需要临床医生结合患者临床特征及传统药敏结果指导目标性抗感染方案。当然，随着mNGS技术的进一步发展与完善，未来将在规范诊断标准、优化质量控制、提高测序准确度、优化分析报告、降低成本等方面逐步得到提升，成为精准抗感染治疗的关键技术。共识在汇总最新国际、国内权威文献的基础上，结合临床实际问题详细介绍了mNGS在检测感染病原体临床应用方面的种种事项，为临床医师规范应用提供了科学指导。尽管如此，感染性疾病的病原学诊断仍要求综合临床与病原微生物特点、流行病学与最佳诊断证据等多方面信息，坚持以患者为核心，以临床特征、组织病理、影像学、微生物学、mNGS等重要辅助检查为一体的综合理念，因此在临床解读报告结果时需要紧密结合临床实践，以审慎的态度分析决策，以更好地指导临床工作。