细胞外囊泡在胰腺癌中的作用研究进展

彭青侠，许小凡，段丽芳，张 红,

(1.陕西中医药大学基础医学院，陕西 西安 712046;2.陕西中医药大学医学科研实验中心，陕西 西安 712046)

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是一种常见的恶性程度高且预后差的消化系统恶性肿瘤，据2018年全球癌症统计学数据显示，PC是世界上第七大最常见的恶性肿瘤，在美国和中国，分别是癌症相关死亡的第四和第六大原因[1]。目前，手术在PC早期具有积极的治疗意义，但由于大多数PC起病隐匿，无法实现早期发现，大多数患者确诊时已处于疾病的中晚期，错过了最佳的手术治疗时期。早期检出率低是PC患者预后差的主要原因之一[2]，此外，PC患者预后不良的主要原因还包括远处转移风险高、化学治疗效果不理想等。因此，早期诊断、抑制转移、探索有效的治疗方法是PC治疗中亟待解决的问题。近年来，细胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)在PC发生、发展和治疗中的作用引起了广泛关注。本文对EV在PC发展、转移以及诊断和治疗中的研究进展进行综述。

1 EV

EV可参与细胞通讯，在细胞间运输DNA、RNA和蛋白质等物质。根据生物学特性或释放途径不同可将EV分为微囊泡(microvesicle，MV)、外泌体、内体和凋亡小体[3]。MV直接从细胞膜释放，直径为100 nm～1 μm[4]；外泌体直径为30～120 nm，由细胞内多泡体释放；内体主要由恶性组织细胞产生，直径为1～10 μm；凋亡小体直径为50 nm～2 μm，由凋亡细胞释放[5]。EV几乎由所有类型的细胞分泌，存在于多种体液，如血浆、唾液、尿液和母乳等[6]。尽管EV的确切生理作用还不清楚，但其被公认为可介导细胞间的特异性通讯，并激活细胞中信号通路的融合或相互作用[7]。大量研究证实，EV存在于肿瘤微环境(tumor micro-environment,TME)中，其主要功能是促进癌症的发展、刺激血管生成、激活TME中的成纤维细胞、产生肿瘤转移前的利基环境并抑制宿主免疫反应等[8-11]。

2 EV促进PC发展及转移的机制

2.1 肿瘤细胞源性EV抑制免疫细胞功能免疫细胞浸润肿瘤是TME的重要组成部分[12]。自然杀伤(natural killer，NK)细胞是先天性淋巴细胞，具有识别和清除病毒感染细胞和恶性细胞的能力[13]。但大量研究显示，在TME中NK细胞处于功能失调状态[14-15]。ZHAO 等[16]采用超速离心法从高转移性PC细胞系L3.6pl 中分离出EV并与NK细胞共培养，结果发现，NK细胞中的天然杀伤基团2D、CD107a、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、血清干扰素(interferon，INF)-γ以及CD71和CD98的表达水平降低，葡萄糖摄取能力受损，使得NK细胞对PC干细胞的细胞毒性减弱，提示PC细胞衍生的EV具有免疫抑制作用。SHEN等[17]研究发现，T淋巴细胞摄取PC外泌体后，PC外泌体可以通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)诱导内质网应激介导T淋巴细胞凋亡，最终导致免疫抑制。肥大细胞(mast cells，MCs)与过敏反应相关，多项研究表明，MCs在肿瘤的发生过程中发挥重要作用[18-19]。一方面，MCs释放趋化因子和启动免疫反应，可能根除肿瘤；另一方面，MCs释放的血管生成因子、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)和免疫抑制性细胞因子可为肿瘤提供支持性环境[20]。有研究发现，在重现细胞间接触的条件下，癌细胞不但可以直接激活MCs，其驱动的EV还具有激活肿瘤周围MCs的可能性[21-22]。以上研究说明，肿瘤源性EV可以通过多种途径作用于多种免疫细胞，使机体免疫功能受到抑制，从而促进肿瘤的发展。

2.2 EV介导的特殊蛋白传递促进PC的转移WEI等[23]研究发现，酪氨酸激酶Eph受体A2(tyrosine kinase Eph receptor A2，EphA2)在高转移PC细胞Panc-1的外泌体中过表达，且EphA2可提高PC细胞的迁移能力。CHE等[24]研究发现，从表达组织因子的胰腺肿瘤细胞株中获得的EV可通过产生活化因子X和裂解蛋白酶激活受体-1激活静息内皮细胞，上调E-选择素并诱导IL-8分泌，将静息的内皮细胞转化为活化的表型从而促进胰腺肿瘤细胞转移。有研究发现，PC细胞PK-45H释放的EV可增强PK-45P细胞MAPK通路的磷酸化，并通过MAPK依赖途径刺激PK-45P细胞迁移，提示PC细胞释放的EV可作用于周围其他PC细胞，这可能是TME中肿瘤细胞转移的重要诱因[25]。

2.3 EV促进肿瘤血管形成血管生成是从现有的内皮细胞中生成新的血管，并向肿瘤组织提供充足氧气和营养的过程，在肿瘤的生长和转移中发挥重要作用[26]。有研究发现，将人微血管内皮细胞(human microvascular endothelial cell，HMVEC)暴露于PC细胞系PANC-1衍生的携带miR-27a的外泌体中，携带miR-27a的PC细胞来源的外泌体可促进HMVEC的增殖、侵袭和血管生成；而将敲除miR-27a基因的PANC-1细胞植入裸鼠体内后，可抑制裸鼠体内PC肿瘤的形成和微血管密度，由此可见，携带miR-27a的细胞源性外泌体在PC血管生成中起着促进作用[27]。另有研究发现，与敲除膜联蛋白 A1(annexin A1,ANXA1)的PC细胞MIA paca-2相比，野生型MIA paca-2细胞能释放更多富含外泌体的EV，且细胞的迁移和侵袭能力更强；而与野生型MIA paca-2细胞释放的 EV共培养后，敲除ANXA1的MIA paca-2细胞迁移和侵袭能力会显著提高，且HMVEC 生成的更快，提示EV相关的ANXA1能够促进PC细胞迁移、侵袭和血管生成[28]。COSTA-SILVA等[29]研究发现，与未发生转移的胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)患者相比，发生肝脏转移的PDAS患者的外泌体中巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)表达较高，其机制可能为库普弗细胞(肝巨噬细胞)摄取PDAC衍生的外泌体，导致肝星状细胞分泌转化生长因子-β和上调纤维连接蛋白的表达，这种纤维化的微环境增强了骨髓源性巨噬细胞的募集，使促炎细胞因子MIF水平升高，促进肿瘤血管生成和增殖，从而导致肝转移。

3 EV在PC诊断中的作用

EV是一种有前景的人类肿瘤诊断生物标志物。研究发现，EV蛋白标记物磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(glypican-1，GPC-1)单独或联合其他蛋白标记物，如表皮生长因子受体、上皮细胞黏附分子，可用于诊断PDAC[30]。MELO等[8]研究发现，GPC-1特异性地富集在癌细胞来源的外泌体上，PC患者血清中GPC-1联合循环外泌体(circulating exosomes,crExos)具有绝对特异性和敏感性，可用于鉴别诊断健康人、胰腺良性疾病患者与早、晚期PC患者，提示GPC-1联合crExos可能作为一种潜在的非侵入性诊断和筛查工具来检测早期PC。但LUCIEN等[31]研究发现，PDAC患者血液中的GPC-1阳性EV和糖蛋白2/GPC-1阳性EV均有不同程度的表达，且与良性胰腺疾病患者比较差异无统计学意义，认为GPC-1阳性EV单独或联合糖蛋白2不能有效区分良性胰腺疾病患者和PC。因此，关于GPC-1是否可以成为PC诊断的生物学标志物，仍需进一步研究。

SHIN等[32]研究发现，转染碱性磷酸酶胎盘样蛋白2的PDAC panc-1细胞的生长和侵袭能力高于未转染的 panc-1细胞，且碱性磷酸酶胎盘样蛋白2在panc-1细胞中呈阳性表达,而在胰腺正常导管上皮细胞中未表达，提示碱性磷酸酶胎盘样蛋白可作为早期诊断PDAC的生物标志物。LECA等[33]研究发现，膜联蛋白A6/低密度脂蛋白受体相关蛋白1/血小板反应素1复合物可使PDAC细胞的侵袭能力提高，而PDAC相关成纤维细胞中缺乏ANXA6会抑制该复合体的形成，进而抑制PDAC的侵袭和转移，同时还发现膜联蛋白A6+EV仅存在于PDAC患者的血清中，提示膜联蛋白A6可作为PDAC诊断的潜在生物标志物。

4 EV参与PC化学治疗耐药的诱导

吉西他滨(gemcitabine，GEM)单药或联合用药仍是PC化学治疗的一线方案，但患者对药物的耐药性是目前影响PC治疗效果的关键因素之一[34]。有研究发现，使用GEM干预PC相关成纤维细胞后，外泌体的释放显著增加；将PC相关成纤维细胞释放的外泌体与PC细胞共培养后发现，PC细胞中耐药诱导因子Snail的表达和PC细胞的增殖能力升高；而用外泌体释放抑制剂GW4869干预PC相关成纤维细胞后，可显著降低该细胞的存活率，表明癌相关成纤维细胞外泌体在PC化学治疗耐药中起促进作用，也显示了外泌体抑制剂与化学治疗药物联合克服PDAC化学治疗耐药的潜力[35]。YANG等[36]研究发现，GEM抗性PC细胞来源的外泌体可通过miR-210介导GEM敏感的PC细胞的耐药性。

FAN等[37]从3株表现出不同程度GEM耐药的PC细胞系(panc-1、MIA-PaCa-2和BxPC-3)中分离出外泌体，检测外泌体在这些细胞系间的耐药性传播能力，结果显示，耐药性PANC-1细胞的外泌体增加了MIA PaCa-2和BxPC-3细胞的GEM抗性；与MIA-PaCa-2和BxPC-3细胞相比，panc-1细胞的外泌体过表达了外泌体EphA2；在panc-1细胞中，敲除EphA2基因抑制了其向MIA-PaCa-2和BxPC-3细胞传递外泌体介导的耐药性；表明外泌体EphA2可以传递耐药性。

5 EV在PC中的潜在治疗作用

KIMURA等[38]研究发现，不同表位的抗分泌细胞骨架相关蛋白4(cytoskeleton-associated protein 4，CKAP4)单抗对Dickkopf1和CKAP4的结合、蛋白激酶B活性以及PDAC细胞的增殖和迁移均有抑制作用，且具有良好的抗肿瘤效果，因此推测抗CKAP4单抗可用于PC的分子靶向治疗和辅助诊断。YING 等[39]研究发现，肿瘤常见致癌基因KRAS的突变形式是PC的关键驱动因素，同时也是一个具有挑战性的PC治疗靶点。KAMERKAR等[40]将来自正常成纤维细胞样间充质细胞的外泌体设计成携带短干扰RNA或短发夹RNA(工程外泌体)，可靶向于特异性致癌基因KrasG12D(这是PC中常见的突变基因)。研究发现，工程外泌体治疗可显著抑制PC小鼠肿瘤生长并显著提高小鼠的总生存率，此研究提供了一种使用工程外泌体直接和特异性靶向PC中致癌基因KRAS的方法[40]。

6 小结

EV在介导PC进展和转移中发挥多重作用，可作为治疗PC的潜在靶点。尽管大量研究都强调了EV在胰腺组织生理和病理条件下的潜在重要作用，但其作为PC早期诊断的生物标志物的相关性研究仍非常局限。这在很大程度上是由于分离高浓度EV存在困难性。目前，关于EV的研究面临的主要挑战之一是缺乏标准化和特征化的分离方法，因此，开拓高质量、标准化的EV的提取方法，是EV研究中最亟待解决的问题。