华蟾素对人肝癌HepG2.2.15细胞体内外增殖的影响及可能的机制*

冯丽丽 汪晓军

1.首都医科大学附属北京佑安医院肝病四科 (北京， 100000) 2.首都医科大学附属北京佑安医院中西医结合中心

华蟾素是中华大蟾蜍皮肤的水提取物，广泛应用于恶性肿瘤、慢性乙型肝炎、全身或局部感染等疾病[1]。为探索华蟾素治疗原发性肝癌(HCC)的疗效和可能机制，本实验通过观察华蟾素对HepG2.2.15细胞的增殖、凋亡以及对p53基因和蛋白表达的影响，探讨华蟾素可能的抗肿瘤机制，为进一步研究华蟾素治疗HCC提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 华蟾素、细胞、裸鼠及主要试剂 华蟾素购自陕西东泰药业有限公司(中国陕西)，溶于生理盐水中，浓度为500 mg/ml。裸鼠用药量为：X mg/kg×70 kg×0.0026/20 g=9.1x mg/kg，其中x是成人用药剂量。HepG2.2.15细胞购买于中国典型培养物保藏中心(中国武汉)。BALB/c裸鼠(n=16；雄性；4周龄；40～50 g)购买自上海杰思捷实验动物有限公司[合格证编号：20180004051445，许可证号码：SCXK(沪)2018-0004]，饲养于厦门大学实验动物中心。小鼠抗p53(sc-47698)和β -tubulin(sc-365791)一抗购自Santa Cruz Biotechnology(美国德克萨斯州)；rabbit anti-p53 (#2527)抗体购自CST(美国波士顿)；Western blot and IP细胞裂解缓冲液(P0013)购买自碧云天生物技术研究所(中国海门)；蛋白质印迹剥离缓冲液(21059)购买于Thermo Scientific(美国麻省)。

1.2 细胞实验 HepG2.2.15细胞用Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)，在5%CO2、90%湿度、37℃的培养箱中培养。①MTT实验:取对数生长期的细胞制成5×104/ml单细胞悬液，按100 μl /孔接种于96孔板中，培养24 h后，华蟾素组给予不同浓度的华蟾素(125 μg/ml，250 μg/ml，500 μg/ml，1 000 μg/ml，2 000 μg/ml)，另设对照组；药物作用48 h后，酶标仪测定各孔吸光值(OD值)。根据公式计算细胞增殖抑制率：抑制率(%)=[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值]×100%。利用SPSS 24.0软件计算细胞的半数生长抑制浓度(IC50)。活性评价：IC50越低，则对肿瘤细胞的生长抑制活性越好。②流式细胞实验:分别收集浓度为540.00 μg/ml、2 319.36 μg/ml的华蟾素处理48 h的 HepG2.2.15细胞及对照组细胞, 制备成浓度为1×106个/ml的单细胞悬液分别加入1.5 ml离心管中，1 500 rpm，5 min，弃上清；加入PBS 1 ml离心洗涤2次，弃上清。加入100 μl 1×结合缓冲液(试剂盒成份)重悬细胞，并加入5 μl磷脂结合蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和10 μl碘化丙啶(PI)，室温避光反应15 min。400 μl结合缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，FL1为绿色荧光，FL2为红色荧光。Cellquest 软件分析细胞凋亡情况。③蛋白免疫印迹法：分组处理细胞，待药物作用48 h后收集细胞(操作步骤同前)，800 rmp离心5 min，1 ml PBS洗2次，吸干PBS，加适量WB/IP裂解液及苯甲基磺酰氟(PMSF)(1 ml裂解液加10 μl PMSF)，冰上裂解30 min，每10 min震荡10 S，1.2×103rpm离心10 min(4℃)，上清液用BCA-100蛋白浓度测定试剂盒测定各组蛋白含量。每组样品各取蛋白40 μg上样，用10% SDS-PAGE 进行电泳。将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶在常温下封闭1 h，依次滴加一抗 (p53单克隆抗体，工作浓度均为1∶750，4℃，过夜)及二抗 (1∶10 000 HRP标记的羊抗鼠IgG，室温，1 h)，设β-actin 为内参，用TBST(10 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，0.1% Tween-20，pH7.6) 洗膜后，采用ECL化学发光法进行观察。④Realtime PCR检测p53基因的表达：分组处理细胞待药物作用48 h后收集细胞(操作步骤同前)，用Trizol提取总RNA，取5μl RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳。用HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒把总RNA反转录成cDNA，p53 (168 bp) 上游引物为5'- GCCATGGCCATCTACAAG-3'，下游引物为5'-CCTTCCACCCGGATAAGAT-3'；内参照GAPDH(110 bp) 上游引物为5'-CCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3'， 下游引物为5'-TGGTCCAGGGGTCTTACTCC-3'。然后根据Ultra SYBR Mixture(with Rox)试剂盒说明书，利用ABI Prism 7500检测系统对引物进行扩增，20 μl反应体系:Ultra SYBR Mixture(2×)10 μl，上游引物(10 μM)0.4 μl，下游引物(10 μM)0.4 μl，模板2 μl，加RNase-free Water至20 μl。PCR循环参数设置：95℃ 10 min，(95℃ 15 s，60℃ 60 s)×40个循环；然后运用comparative 2-△△CT法分析各基因的相对表达。

1.3 动物实验 裸鼠饲养在SPF环境中，温度26～28℃，相对湿度30%～40%，12 h/12 h暗光循环，可自由获取食物和水。将浓度2×107个/ml的HepG2.2.15细胞按每只0.2 ml接种于裸鼠腋皮下，约20 d后待肿瘤长至50～200 mm3时，根据瘤体积大致相等的原则分为2组：对照组6只，华蟾素组10只，灌胃0.2 ml，每日1次，连续15 d，对照组灌等体积的生理盐水。每两天一次测量裸鼠体重，游标卡尺测量瘤组织的长短径，按计算公式V=ab2/2计算肿瘤的体积(体积：V，肿瘤长径：a，肿瘤短径：b)。第16天称体重，处死小鼠后取瘤组织。用WB/IP裂解缓冲液裂解移植瘤。BCA试剂盒(Thermo，NCI1059CH)进行蛋白质定量。于SDS-PAGE跑胶，转膜，一抗在4℃孵育过夜。二抗在室温下孵育1小时，ECL显影。在Bio-Rad的ChemiDOC XRS+成像系统(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)显影成像。用Image Lab 5.0版软件(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)分析灰度值。

1.4 统计学方法 使用SPSS 24.0进行统计学分析。使用双尾t检验，双向ANOVA和Mann-Whitney检验进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 华蟾素对体外培养的HepG2.2.15细胞增殖和凋亡的影响 MTT实验结果表明，华蟾素对HepG2.2.15细胞的抑制作用随浓度的升高而增加，当浓度分别为125 μg/ml、250 μg/ml、500 μg/ml、1 000 μg/ml、2 000 μg/ml时，相应的抑制率分别为24.30%、41.831%、49.62%、64.14%、80.65%(图1A)。根据所得抑制率及相对应的药物浓度，计算获得华蟾素IC50和IC80浓度值分别为540.00 μg/ml和2319.36 μg/ml(图1A、1B)。流式细胞学检测结果显示，华蟾素IC50组、IC80组细胞凋亡率明显高于对照组，同时IC80组细胞凋亡率高于IC50组，差异均有统计学意义。由此可见，华蟾素可明显促进HepG2.2.15细胞凋亡，且随着药物浓度增加，细胞凋亡率相应升高，二者之间具有一定的浓度依赖关系(图1C～F)。

图1 华蟾素对体外培养的HepG2.2.15细胞增殖和凋亡的影响

2.2 华蟾素对荷瘤裸鼠移植瘤体积的影响 分组给药后，分别监测两组裸鼠的体重及移植瘤体积的变化。在整个实验过程中，华蟾素组与对照组裸鼠体重之间的对比没有差异(P>0.05，图2C)，证明两组之间具有可比性；从移植瘤体积的变化中我们可以看出，华蟾素组自用药第5天起，移植瘤体积的增长率明显降低，与对照组相比具有统计学意义(0.424±0.472 4vs1.345±1.1276，P<0.05，图2B)。

图2 华蟾素对荷瘤裸鼠移植瘤体积和肝功能的影响

2.3 华蟾素对体内外培养的HepG2.2.15细胞p53表达的影响 动物实验结果显示，华蟾素组裸鼠移植瘤组织中的p53蛋白表达量明显高于对照组，差异具有统计学意义(图3a、b)；细胞学实验部分结果显示，华蟾素组(包括IC50组及IC80组)细胞中p53蛋白及p53 mRNA表达量与对照组相比均明显增加(图4c～f)，差异均具有统计学意义(P<0.05)；且华蟾素IC80组p53蛋白及p53 mRNA表达明显高于IC50组，差异具有统计学意义(P<0.05)。因此可见，华蟾素可促进p53蛋白及基因的表达，且具有一定的浓度依赖性。

图3 华蟾素对体内外培养的HepG2.2.15细胞p53表达的影响

3 讨论

在我国，HCC是仅次于胰腺癌的第二大致死性肿瘤[2]，慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是我国肝癌的最主要病因，约85%的HCC患者携带HBV感染标志[3,4]。Maucort-B等[5]的研究中纳入了全球770 000例HCC病例，结果显示超过50%的病例归因于慢性HBV感染，与HCC风险有关的HBV相关因素包括高病毒载量、HBeAg阳性状态、基因型(C型、F型)、病毒变异以及伴有肝硬化等[6,7]；多项研究表明，这些因素对切除术后HCC复发和患者生存情况亦有负面影响[8,9]，而采用干扰素或核苷(酸)衍生物抑制HBV复制后，HCC的相对危险度可下降50%～60%[10]。本次实验中采用的HepG2.2.15细胞是将含有HBV基因组的重组载体质粒pDolTHBV-1转染人肝癌细胞株HepG2，经G418筛选而建立的细胞系，可稳定分泌HBsAg、HBeAg及完整的Dane颗粒。为了更好地模拟实验药物在体内对肝癌的影响，我们还将HepG2.2.15细胞接种于裸鼠腋皮下，从而成功建立裸鼠人肝癌移植瘤模型，为今后研究HBV相关HCC提供了一个很好的动物模型。

目前HCC的治疗方案主要有手术切除、肝移植、经皮局部消融、化疗和分子靶向治疗等[11]，但因各种限制因素很难取得理想疗效；中医药治疗HCC可明显改善患者症状，毒副反应小，保持较好全身状态，延长带瘤生存期等，在中晚期肝癌的综合治疗中占据越来越重要的地位，其中华蟾素在HCC的中医药治疗中占有重要的地位。华蟾素有清热解毒、利水消胀、化癖软坚等功效，可以起到抑制肿瘤生长、延长生存期、改善生存质量等作用[12,13]。相关基础研究也发现，华蟾素可将体外培养的HepG2细胞阻滞于G2/M期，促进细胞凋亡，其机制可能与调节凋亡相关因子Bcl-2、Bax及p53等的表达有关[14]；华蟾素及其有效成分可通过抑制细胞增殖，破坏细胞周期，抑制血管生成，逆转多药耐药性，调节免疫应答等途径来展现显著的抗肿瘤活性[15]。本次实验结果显示，华蟾素对HBV相关HCC的生长具有明显的抑制作用。

除此之外，肿瘤的发生也与抑癌基因有关，其中p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，实验研究表明表达HBx的肝细胞和HBx/c-myc双基因敲入的小鼠中都发生了染色质重塑复合物成分(ZNF198和SUZ12)的下调，这种下调最终导致p53介导的细胞凋亡的水平降低[16,17]；同时HBx蛋白可以与p53蛋白结合使其失活[18]。p53蛋白可通过与病毒增强子相互作用，抑制HBV基因转录和抗原表达[19]。本次实验结果显示华蟾素可能是通过p53通路抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡，进而抑制肿瘤的生长，但具体的作用机制尚需进一步研究。

通过本次研究我们可以发现，华蟾素可以抑制HBV相关肝癌细胞增殖，促进细胞凋亡，从而抑制HCC生长，机制可能与促进p53基因表达有关。