基于网络药理学和生物信息学的结肠炎奇效颗粒治疗溃疡性结肠炎作用机制研究

孙钰婧 霍志鹏 王 玉 李瑞明 秦民坚 何 毅▲

1.天士力控股集团有限公司 天士力研究院/创新中药关键技术国家级重点实验室，天津 300410；2.中国药科大学中药学院，江苏南京 210009

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种结肠和直肠慢性非特异性炎性肠病，以结肠黏膜连续性、弥漫性炎症为主要特点，病程漫长，以血性腹泻、腹痛等为主要临床表现，长期严重可并发消化道穿孔和结肠癌[1]，严重影响了患者的生活质量和心理状况，目前认为UC 的发生以遗传因素为基础，在心理及环境因素的持续诱发下，肠道黏膜屏障受损，肠内菌群失调，导致免疫功能紊乱[2]，但具体病因尚不十分明确。临床上，西医治疗以口服氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、免疫抑制剂等为主，配合全身支持治疗，重症患者考虑手术治疗[3-4]；中医治疗常口服复方中药或有效成分，采用中药灌肠、针灸等不同形式的疗法[3]，多层次综合作用于患者及患处。结肠炎奇效颗粒是课题组开发的中药六类新药，由骨碎补、生车前子等6 味中药组成，具有温肾暖脾、化瘀导滞之功效，用于慢性非特异性UC 的治疗[5]，目前处于Ⅱ期临床阶段。前期研究表明，结肠炎奇效颗粒能够明显减轻冰醋酸、葡聚糖硫酸钠和三硝基苯磺酸所致的UC 小鼠、大鼠结肠炎症和溃疡病变程度[6]，但结肠炎奇效颗粒的药效物质基础和作用机制尚不明确。

研究采用网络药理学和生物信息学方法，通过构建“药物-疾病-靶点”网络从整体角度分析结肠炎奇效颗粒治疗UC 的作用机制，预测该方治疗UC 的关键靶基因，并对其进行生物功能和代谢通路分析，旨在初步认识该方治疗UC 的作用机制，为进一步的实验验证提供依据。

1 材料与方法

1.1 活性成分的筛选

在中药系统药理学分析平台（pharmacology analysis platform of traditional Chinese medicine system，TCMSP）数据库、化学专业数据库及参考文献中搜集各药材化学成分，结合前期质谱鉴定结果，初步获取化学成分，并在TCMSP 和SwissADME 数据库中筛选出口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且类药性（drug-like，DL）≥0.18 的化学成分作为潜在活性成分。

1.2 活性成分靶点预测

将活性成分导入TCMSP 和化学专业数据库中查询作用靶点，利用Uniprot 数据库将靶点名称校正为官方名称（Official Symbol），校正后导入STRING 进行蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，去除无相互作用靶点，借助Cytoscape（version 3.7.1）构建结肠炎奇效颗粒活性成分-靶点PPI 网络。

1.3 UC 疾病靶点预测

将关键词“Ulcerative Colitis”输入DiGSeE 和Gene Cards 收集疾病靶点，使用Draw Venn Diagram 在线工具绘制韦恩图筛选共有靶点作为疾病靶点。将活性成分靶点信息和疾病靶点导入在线工具中预测“药物-疾病”交集靶标，利用STRING 数据库绘制交集靶标PPI图。

1.4“药物-疾病-靶点”网络的构建

依据活性成分靶点和“药物-疾病”交集靶标，使用Cytoscape 分别构建“中药-药材-活性成分”网络和“活性成分-交集靶标-疾病”网络，使用merge 功能合并两个网络以构建“药物-疾病-靶点”PPI 网络。

1.5 核心靶点的筛选

将“药物-疾病” 交集靶标导入STRING 中进行PPI 分析，再利用Cytoscape 以大于Degree 中位数为标准筛选核心靶点。

1.6 GO 生物功能和KEGG 代谢通路富集分析

通过DAVID 数据库对核心靶点进行GO 功能富集分析和KEGG 代谢通路富集分析，以FDR＜0.01 作为显著富集标准，筛选得富集结果，再通过R 软件（R×64 3.6.3）对富集结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 活性成分及作用靶点的筛选

结合TCMSP 数据库、参考文献及前期质谱鉴定结果，共获得化学成分102 个。TCMSP 和SwissADME数据库中活性成分筛选结果显示，同时满足OB≥30%和DL≥0.18 或符合Lipinski 规则的化学成分共12个，见表1，包括骨碎补成分3 个，车前子成分3 个，山楂成分8 个以及诃子肉成分6 个。

表1 结肠炎奇效颗粒的12 个活性成分

利用Uniprot 数据库进行靶点校正、 去重后，共获得靶点269 个，将其导入STRING 进行PPI 分析，结果导入Cytoscape 软件中构建化合物-靶点PPI 网络见图1（封三），蓝色节点代表靶点，绿色节点代表活性成分。

图1 结肠炎奇效颗粒的活性成分-靶点PPI 图

2.2 疾病靶点及“药物-疾病”交集靶标预测

在DiGSeE 数据库和GeneCards 数据库中分别得到“Ulcerative Colitis”相关靶点1322 和4356 个，通过绘制韦恩图筛选疾病靶点413 个。“药物-疾病”交集靶标预测过程中，共筛选交集靶标64 个，见图2。

图2 药物-疾病交集靶标预测

图3（封三）为STRING 数据库绘制的交集靶标PPI 图，该网络由64 个节点、893 条边组成，网络密度为0.744，平均节点度为27.9。

图3 药物-疾病交集靶标PPI 图

2.3“药物-疾病-靶点”PPI 网络构建

将交集靶标和活性成分导入Cytoscape 软件中构建“药物-疾病-靶点”PPI 网络，由12 个活性成分，64个交集靶标，82 个节点，252 条边组成的“药物-疾病-靶点”PPI 网络，见图4（封四）。

2.4 核心靶点筛选

64 个“药物-疾病”交集靶标导入STRING 数据库后，PPI 分析结果显示，交集靶点均具有相互作用，将结果导入Cytoscape 软件中，以Degree 值的中位数27.5 为标准，筛选核心靶点共32 个，见图5（封四）。Degree 值越大，图中靶点的直径越大。

2.5 GO 功能富集分析

通过DAVID 数据库对核心靶点进行GO 功能富集分析，从生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组成（cellular component，CC）3 个方面阐述核心靶点的生物学作用，共获得32 个功能富集（FDR＜0.01），包含25 个显著富集的生物过程，主要涉及一氧化氮生物合成过程的正调控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、蛋白质磷酸化的正调控（positive regulation of protein phosphorylation）等；3 个显著富集的分子功能：细胞因子活性（cytokine activity）、酶结合（enzyme binding） 以及相同的蛋白质结合 （identical protein binding）过程；4 个显著富集的细胞组成，包括胞外区空间（extracellular space）、细胞外区域（extracellular region）、陷窝（caveola）以及质膜的外侧（external side of plasma membrane）。GO 富集功能分析结果见图6（封四）。

2.6 KEGG 通路富集分析

将核心靶点导入DAVID 数据库中进行KEGG 通路富集分析，发现核心靶点主要富集于癌症途径（pathways in cancer）、HIF-1 信号通路（HIF-1 signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）等32 条通路中（FDR＜0.01），提示这些通路可能是结肠炎奇效颗粒治疗UC 的重要机制。利用R软件绘制KEGG 富集通路气泡图，见图7（封四）。气泡大小代表基因数目，颜色越深，FDR 值越小。

3 讨论

“药物-疾病-靶点”网络中槲皮素（Degree 值=53）、柚皮苷（Degree 值=14）和没食子酸（Degree 值=10）与疾病靶标相关度最高，提示其可能是全方治疗UC 的主要活性成分。据文献报道，车前子和山楂成分槲皮素具有良好的抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌效果[7]；没食子酸可以调节葡聚糖硫酸钠所致UC 小鼠的白细胞介素-21、白细胞介素-23 等炎症细胞因子的表达[8]；柚皮苷作为骨碎补总黄酮的主要成分，能够减轻炎症反应，改善微循环，加速细胞增殖[9]，同时还能促进一些药物在人体内的代谢吸收[10]，提示结肠炎奇效颗粒对UC 的治疗作用是多种成分共同作用的结果，体现了中药配伍优势。

核心靶点筛选结果发现，白细胞介素-6（Degree值=59）和肿瘤坏死因子（Degree 值=54）是核心靶点网络的枢纽，由二者表达的细胞因子白细胞介素-6 和肿瘤坏死因子-α 在炎症反应、细胞免疫、肿瘤免疫等多种生理病理过程中发挥十分关键的作用[11-12]，提示结肠炎奇效颗粒可能通过调节二者介导的多种炎症和免疫途径发挥治疗作用。

GO 功能富集分析结果显示，结肠炎奇效颗粒参与炎症反应、血管生成、平滑肌细胞增殖的正调控、寄主共生体生长的负调控、趋化因子生物合成过程的正调控、NO 生物合成过程的正调控等生物过程，可能通过上调NO 水平，激活鸟苷酸环化酶（guanylate cyclase，GC）使环鸟苷酸（cyclic guanosine monophosphate，c-GMP）增加，抑制表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）信号通路[13]，正调控平滑肌细胞的增殖和新血管的生成以修复结肠受损部位；促进趋化因子合成，招募并活化T、B 细胞以清除病原体[14]；同时调节肠道菌群，来达到减轻肠道炎症和溃疡程度的目的，且其调控过程多发生在extracellular space中。

KEGG 通路富集分析结果显示，结肠炎奇效颗粒可能通过调节肿瘤坏死因子通路、NOD 样受体通路、Toll 样受体通路、FoxO 通路、PI3K-Akt 通路、HIF-1通路、NF-κB 通路、T 细胞受体通路等信号通路来发挥药效。其中肿瘤坏死因子信号通路通过肿瘤坏死因子-α 和肿瘤坏死因子-β 两细胞因子作用于肿瘤坏死因子R1 和肿瘤坏死因子R2 受体来激活NF-κB 和MAPK 通路[15]；NOD 样受体（NOD-like receptors，Nods）作为先天免疫系统受体，识别胞内的病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），驱动NF-κB 和MAPK 通路的激活[16]；Toll 样受体（Tolllike receptors，TLRs）作为另一种重要的先天免疫反应受体，同样识别PAMPs 以激活NF-κB 和MAPK 通路，但与Nods 不同的是，TLRs 通过髓样分化蛋白抗原（myeloid differential protein-88，MyD88）依赖性和MyD88 非依赖性两条信号通路将其激活[17-18]；PI3KAkt 通路也可激活NF-κB 通路和MAPK 通路等炎症通路[19]。可见，NF-κB 和MAPK 两条通路是各通路的潜在中心。NF-κB 在炎症反应过程中起到关键的调控作用，能促进白细胞介素-1β、白细胞介素-6 等炎症因子的表达[20]；活化p38 MAPK 信号通路可以上调细胞因子Gro-α、白细胞介素-8 的表达，促进克罗恩病（Crohn′s disease，CD）肠道炎症的形成[21]；药理实验也显示，结肠炎奇效颗粒三个剂量组均能显著降低葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的UC 大鼠血浆中的肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-8、NF-κB p65 和细胞黏附分子-1 的含量（P＜0.01）[6，22]。因此推测，结肠炎奇效颗粒可能通过直接或间接地阻断NF-κB 和MAPK 两条通路，调控下游白细胞介素-6、肿瘤坏死因子等细胞因子的合成，起到抗炎、促进肠道蠕动、平衡肠道内环境，修复粘膜损伤等作用。另外，KEGG 富集结果中存在多条与肠道炎症和癌症相关的通路，如炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）、 阿米巴病、FoxO 通路、HIF-1 通路、 癌症途径等。据报道，UC 是结直肠癌（colorectal cancer，CAC）的一个重要病因，由UC 引起的CAC 占所有结直肠癌的1%～2%[23]，UC 癌变总体发生率为3.7%，且其炎-癌转化率随着UC 病程的延长逐年增加，UC 发病30年后，CAC 的发生率高达18.4%[24]。已有研究表明，激活FoxO 通路可降低FoxO3a 抑癌基因的表达[25]，激活HIF-1 通路可导致致癌因子的扩散[26]，从而加速癌细胞的转移和侵袭，提示结肠炎奇效颗粒可能有预防UC 癌变的活性，其作用机制可能与阻断FoxO、HIF-1 等通路，提高FoxO3a 抑癌基因的表达，减缓致癌因子的扩散有关，该活性和机制有待进一步验证。