超高压液相色谱-串联质谱法测定速溶咖啡和曲奇饼干中丙烯酰胺的含量

郇志博,段 云,徐 志,王明月,罗金辉,田 海,张利强,韩丙军

(1.中国热带农业科学院 分析测试中心,海口 571101; 2.海南省热带果蔬产品质量安全重点实验室,海口 571101;3.农业农村部热作产品质量安全风险评估实验室,海口 571101; 4.海南省院士工作站,海口 571101)

丙烯酰胺被国际癌症研究机构(IARC)列为2A类致癌物,即“人类可能致癌物”[1]。2002年瑞典科学家发现富含淀粉的高温热加工食品(如饼干、薯条等)中含有大量的丙烯酰胺[2];2018年,全球咖啡行业因美国加州法院裁定星巴克咖啡中含有“可能致癌”的丙烯酰胺而遭受巨大影响。因此,监测食品中丙烯酰胺的含量对保障消费者的食品安全具有重要意义。

2014年我国发布了国家标准GB 5009.204－2014《食品安全国家标准 食品中丙烯酰胺的测定》,该标准建立了稳定性同位素稀释的液相色谱-串联质谱法和稳定同位素稀释的气相色谱-串联质谱法两种方法来测定热加工(如煎、炙烤、焙烤等)食品中丙烯酰胺的含量。同时,国内外也报道了许多关于食品中丙烯酰胺的测定方法:文献[3]采用高效液相色谱法测定曲奇饼干中丙烯酰胺的含量;文献[4]采用高效液相色谱-四极杆质谱法测定饼干中丙烯酰胺的含量;文献[5]采用QuECh ERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定咖啡中丙烯酰胺;文献[6]采用超高效液相色谱-大气压化学电离-串联质谱法测定烘焙咖啡中丙烯酰胺。

国家标准GB 5009.204－2014推荐的测定方法前处理操作步骤复杂,耗时较长,无法对大批量样品进行分析[6]。另外,前期试验发现,速溶咖啡和曲奇饼干两种样品的基质差异较大,曲奇饼干中含有较多的油脂成分,而速溶咖啡中含有较多的极性成分,目前的参考文献和国家标准难以同时快速、准确地测定两种基质中丙烯酰胺的含量。因此,本工作在前期研究的基础上,通过优化色谱条件和净化方法,建立了超高压液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)同时测定速溶咖啡和曲奇饼干中丙烯酰胺含量的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

AB SCIEX TRIPLE QUADTM6500＋型超高压液相色谱-串联质谱仪;T25型匀浆机;Milli-Q型超纯水器;CR22GIII型高速冷冻离心机;SENCO型旋转蒸发仪。

丙烯酰胺标准储备溶液:100 mg·L－1。

内标(13C3-丙烯酰胺)储备溶液:100 mg·L－1。

丙烯酰胺标准溶液:5.00 mg·L－1,移取0.5 mL的丙烯酰胺标准储备溶液于10 mL容量瓶中,用水定容,配制成5.00 mg·L－1的丙烯酰胺标准溶液。使用时,用水稀释至所需质量浓度。同法制得5.00 mg·L－1的内标溶液。

甲醇、乙腈、正己烷均为色谱纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 Aglient Eclipse Plus C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.8μm);柱温30℃;进样体积1μL;流动相为5%(体积分数,下同)甲醇溶液,流量0.15 mL·min－1,等度洗脱。

2)质谱条件 电喷雾离子(ESI)源,正离子扫描;多反应监测(MRM)模式;喷雾电压5 500.0 V;离子源温度550.0℃;雾化气压力379 Pa,加热气压力379 Pa,气帘气压力276 Pa,碰撞室压力55.2 Pa;碰撞室入口电压和出口电压均为10.0 V;驻留时间100.0 ms。

丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺的质谱参数见表1,其中,“*”代表定量离子。

表1 丙烯酰胺与13 C3-丙烯酰胺的质谱参数Tab.1 MS parameters of acrylamide and 13 C3-acrylamide

1.3 试验方法

1.3.1 样品提取

分别称取2.0 g速溶咖啡粉末和曲奇饼干样品粉末于50 mL离心管中,加入10 mL乙腈,以转速3 000 r·min－1匀质1 min,再于4℃以转速9 000 r·min－1离心3 min,将上清液转移至新的离心管中。在残渣中再加入10 mL乙腈,涡旋30 s,于4℃以转速9 000 r·min－1离心3 min,合并两次上清液。在上清液中加入10 mL正己烷,涡旋2 min,于4℃以转速9 000 r·min－1离心3 min,除去上层正己烷相,再次加入10 mL正己烷,重复操作,除去上层正己烷相。

1.3.2 样品净化

取10 mL下层乙腈相于50 mL圆底烧瓶中,于40℃减压浓缩至近干,加入1 mL水溶解,经0.45μm水系滤膜过滤,按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按照仪器工作条件,对丙烯酰胺质量浓度均为0.05 mg·L－1的丙烯酰胺标准溶液、曲奇饼干空白样品加标溶液和速溶咖啡空白样品加标溶液进行测定,所得提取离子流色谱图见图1。

图1 提取离子流色谱图Fig.1 Extracted ion chromatograms

2.2 样品前处理条件的优化

2.2.1 样品的提取

不同的提取和净化方法对样品的测定结果有很大影响。国家标准GB 5009.204－2014和文献[4,7-8]直接用水作为饼干中丙烯酰胺的提取剂,然后用正己烷除脂;文献[6]以甲醇为提取剂,提取咖啡中的丙烯酰胺;文献[9-10]以乙腈-水混合液为提取剂;文献[11]单独使用乙腈为提取剂。试验分别以水、乙腈-水混合液、甲醇、乙腈为提取剂,用正己烷除脂,考察了上述提取剂对速溶咖啡和曲奇饼干样品中丙烯酰胺提取效果的影响。结果表明:以水为提取剂时,水与咖啡粉末形成悬浊液,难以通过离心获得上清液,严重影响净化步骤;以乙腈-水混合液为提取剂时,乙腈和水容易分层,而且丙烯酰胺在两相中均有溶解,造成测定结果不准确;以甲醇为提取剂时,甲醇极性较强,导致提取液中含有大量的极性干扰物质,与丙烯酰胺难以分开;以乙腈为提取剂时,速溶咖啡和曲奇饼干中的丙烯酰胺均可被较好提取。因此,试验选择以乙腈为提取剂,用正己烷除脂。

2.2.2 样品的净化

按照试验方法提取样品,参考国家标准GB 5009.204－2014和相关文献[4,11-12]设计了4种净化方法:① 取10 mL下层乙腈相于50 mL圆底烧瓶中,于40℃减压浓缩至近干,加入1 mL水溶解,经0.45μm水系滤膜过滤,按仪器工作条件进行测定;② 取10 mL下层乙腈相,采用Oasis HLB(500 mg/6 mL)和Bond Elut-AccuCAT(200 mg/6 mL)固相萃取小柱净化,净化过程参照国家标准GB 5009.204－2014,最后加入1 mL水溶解,经0.45μm水系滤膜过滤,按仪器工作条件进行测定;③取10 mL下层乙腈相,采用经3 mL甲醇和3 mL水活化的HLB固相萃取小柱净化,收集流出液,再用3 mL水洗脱,收集全部洗脱液,在氮气下将流出液浓缩至近干,最后用1 mL水溶解,经0.45μm水系滤膜过滤,按仪器工作条件进行测定;④ 取10 mL下层乙腈相,加入0.2 g N-丙基乙二胺,充分振荡,于4℃以转速9 000 r·min－1离心3 min,将上清液全部转移至50 mL圆底烧瓶中,于40℃蒸发浓缩至近干,加入1 mL水溶解,经0.45μm水系滤膜过滤,按仪器工作条件进行测定。试验考察了上述4种净化方法对速溶咖啡和曲奇饼干中丙烯酰胺回收率的影响(加标量均为0.1 mg·kg－1),并计算测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表2。

结果表明:经方法②处理后,速溶咖啡和曲奇饼干中基本检测不到丙烯酰胺,回收率仅为0.5%和0.2%;经方法③和方法④处理后,丙烯酰胺的峰形较差且回收率较低;经方法①处理后,速溶咖啡和曲奇饼干中丙烯酰胺的回收率分别为99.6%和111%。因此,试验选择方法①来净化样品。

2.3 色谱条件的优化

丙烯酰胺属于强极性物质,在C18色谱柱上的保留时间较短,容易受基质干扰[7]。为了获得最佳的分离效果,试验参照国家标准及相关文献[6-7,11-15],考察了不同流动相体系[甲醇-水、甲醇-0.1%(体积分数)甲酸溶液、乙腈-水]对曲奇饼干和速溶咖啡样品中丙烯酰胺分离效果的影响。结果显示:对于曲奇饼干样品,不同流动相体系均能较好地分离丙烯酰胺;而对于速溶咖啡样品,不同流动相体系对丙烯酰胺分离效果的影响较大;当以甲醇-水体系为流动相时,速溶咖啡中的丙烯酰胺可被较好地分离。因此,试验选择甲醇-水体系为流动相。

试验进一步考察了体积分数为5%,10%,20%的甲醇溶液在流量为0.20 mL·min－1以及体积分数为5%的甲醇溶液在流量为0.10,0.15,0.20 mL·min－1时对曲奇饼干和速溶咖啡样品中丙烯酰胺分离效果的影响。

结果表明:对于曲奇饼干样品,当流量为0.20 mL·min－1时,甲醇体积分数的改变对分离丙烯酰胺的影响较小;当流动相为5%甲醇溶液时,随着流量的减小,丙烯酰胺与杂质峰的分离情况基本保持不变,说明甲醇体积分数和流量对曲奇饼干样品中丙烯酰胺的分离效果影响均不大。

对于速溶咖啡样品,当流量为0.20 mL·min－1时,随着甲醇体积分数的减小,丙烯酰胺与杂质峰的分离度逐渐增大[图2(a)、(b)和(c)];当流动相为5%甲醇溶液,流量为0.15 mL·min－1时,速溶咖啡样品中丙烯酰胺的分离效果较好[图2(d)],无肩峰和拖尾,且响应值较高。因此,试验最终选择流动相为5%甲醇溶液,流量为0.15 mL·min－1,以分离曲奇饼干和速溶咖啡样品中的丙烯酰胺。

2.4 质谱条件的优化

分别取 1 mL 0.10 mg·L－1的丙烯酰胺(CH2＝CH－CO－NH2)和13C3-丙烯酰胺(13CH2＝13CH－13CO－NH2)标准溶液,经针泵进质谱仪。由于丙烯酰胺带有一个氨基基团,容易与质子结合,因此选择正离子扫描模式。确定丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺的母离子Q1分别为m/z 72.0(CH2＝CH－CO－NH3＋)和 75.0(13CH2＝13CH－13CO－NH3＋),丙烯酰胺经碰撞室碰撞后产生的子离子Q3分别为m/z 55.0(CH2＝CHCO＋)和44.0(NH2－CO＋),选择丰度最强的子离子m/z 55.0为定量离子,m/z 44.0为定性离子。13C3-丙烯酰胺经碰撞室碰撞后产生的子离子分别为m/z 58.0(13CH2＝13CH －13CO＋)和 45.0(NH2－13CO＋),选择m/z 58.0为定量离子,m/z 45.0为定性离子。进一步优化去簇电压和碰撞能量,优化后的质谱参数见表1。

2.5 标准曲线和检出限

移取适量的5.00 mg·L－1丙烯酰胺标准溶液和内标溶液,用水逐级稀释,配制成丙烯酰胺质量浓度 分 别 为 0.005,0.01,0.05,0.10,0.50,1.00 mg·L－1,内标质量浓度均为0.1 mg·L－1的标准溶液系列,按照仪器工作条件进样分析。以丙烯酰胺的质量浓度为横坐标,以丙烯酰胺与内标物的峰面积比值为纵坐标绘制标准曲线。结果表明:丙烯酰胺标准曲线的线性范围为0.005～1.00 mg·L－1,线性回归方程为y＝7.429 x＋1.100×10－3,相关系数为0.999 9。

以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),计算得检出限为0.000 3 mg·L－1,测定下限为0.001 mg·L－1。目前国内外未建立饼干中丙烯酰胺的最大残留限量标准,欧盟规定烘焙咖啡和速溶咖啡中丙烯酰胺的限量值分别为0.40,0.85 mg·kg－1,该方法满足测定要求。

2.6 精密度和回收试验

按照试验方法对市场购买的5种速溶咖啡和5种曲奇饼干样品进行低(0.05 mg·kg－1)、中(0.10 mg·kg－1)、高(0.50 mg·kg－1)等3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定5次,计算回收率和测定值的RSD,结果见表3。

表3 精密度和回收试验结果(n＝5)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

由表3可知,丙烯酰胺在不同种类的速溶咖啡和曲奇饼干中的回收率为88.9%～111%,RSD为2.5%～14%,符合国家标准GB/T 32465－2015《化学分析方法验证确认和内部质量控制要求》的要求[16]。

目前针对咖啡或饼干样品中丙烯酰胺的测定已有报道,但是缺乏同时测定不同类型基质中丙烯酰胺的方法。本工作参考国家标准和相关文献,设计了一种2次乙腈提取,2次正己烷除脂的提取净化方法处理富含极性组分的速溶咖啡和富含油脂组分的曲奇饼干,采用UHPLC-MS/MS同时测定速溶咖啡和曲奇饼干中丙烯酰胺的含量,该方法不需要经过复杂的固相萃取过程,步骤简单,耗时较短,满足测定要求。