海南黑山羊GH1基因SNPs筛选及其与生长性状的关联性分析

管凇 周汉林 徐铁山 孙卫平 胡海超

(中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 海南海口 571101)

海南黑山羊是海南唯一的地方优良山羊品种，在海南各市、县均有分布，但是，生长缓慢，繁殖力低，个体小，产肉性能低，出栏率低，市场供不应求，缺口大，严重影响海南黑山羊的产业化和规模化发展。海南黑山羊经济性状多受遗传因素的影响。目前，针对海南养羊业发展现状，扩大群体数量，保护黑山羊优良的遗传基因的同时，培育出高产又具海南特色的黑山羊新品种，进一步提高品种生产性能、产肉性能和繁殖性能，推动海南养羊业规模化、产业化发展势在必行。因此，通过分子手段对海南黑山羊生长性状的遗传基础进行解析，可以为海南黑山羊的分子育种提供一定的参考依据。

根据研究表明，生长激素1基因（GH1）可能是导致个体矮小的基因，为2.54 kb，由5个外显子和4个内含子组成［1］，是控制哺乳动物的新陈代谢和生长性状的基因。山羊GH1基因的遗传多态性已经报道［1-2］，其他牲畜物种也有研究［3-6］。在埃及和沙特山羊［1］和中国波尔山羊［2］群体中发现GH1多态现象与生长性状有关。Wickramaratne等［7］提出，GH1基因可用于生长性能的标记辅助选择。在南非山羊品种内和品种间存在GH1的遗传多样性，在外显子2和5处观察到导致氨基酸变化的突变［8］。

本研究对海南黑山羊GH1基因编码区进行SNPs筛选，并与生长性状进行关联性分析，旨在筛选可能影响海南黑山羊生长性状的分子标记突变位点，也为应用标记辅助选择改良山羊生长等重要经济性状提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

海南黑山羊来自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所山羊保种场。

1.2 方法

1.2.1 样品采集和DNA处理

对104只成年山羊的体长、体高、体重进行测量。剪取耳组织，置于装有75%乙醇的离心管中，4℃保存。采用DNA提取试剂盒提取耳组织总DNA，用紫外分光光度计检验每个样品DNA质量浓度。

1.2.2 引物设计

从NCBI数据库中查询山羊GH1基因DNA序列（GenBank登录号：NC_030826），根据单核苷酸多态性位点的序列信息，利用引物设计软件Primer Plex 2设计引物，使用primer3plus在线设计单碱基延伸引物，引物信息见表1。

表1 引物信息

1.2.3 SNP位点的筛选和分型

对提取的DNA基因组序列进行扩增，PCR扩增反应总体积为 10 μL：5 μL 5×TaqPCRmastermix，上下游引物各0.5 μL（20 μmol/L），模板DNA 1 μL（20ng/μL），加ddH2O至10μL。PCR扩增程序：94℃预变性5 min；40个循环 （94℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃30 min）；72℃再延伸3 min。将PCR产物去除体系中游离的dNTPs，再进行单碱基延伸反应，反应体系总体积5 μL。PCR产物委托武汉天一辉远生物科技有限公司采用SnaPshot方法，用Gene marker分析得到的.fsa结果，导出峰图及表格文件，并统计出每个样品的SNP位点的基因型。

1.2.4 数据分析

利用Popgene 32（version 3.2）软件和PICCALC程序对SNPs位点的分型结果进行处理，计算遗传参数信息。采用SPSS 2.0软件X2检验对群体中各SNPs位点的基因型频率和等位基因频率进行差异显著性检验，从而与生长性状（体长、体高、体重）性状进行关联分析。

2 结果与分析

2.1 SNPs位点在群体中的遗传参数分析

10个SNPs位点中有4个错义突变，6个为同义突变，错义突变位点分别是Exon1-350G→A（G31S）、Exon2-739G→A（G85S），Exon3-1101A→G（D129G）、Exon3-1154C→T（R147W）。多态信息含量（PIC）是衡量基因变异程度的指标，当PIC＞0.5时，属于高度变异多态；当0.25＜PIC＜0.5时，属于中度变异多态；当PIC＜0.25是属于低度多态变异。10个SNPs位点在海南黑山羊群体中所统计分析得出的遗传参数值见表2，有9个SNPs位点都属于中度多态位点，一个位点处于低度多态，9个位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态（p＞0.05），一个位点没有检测到P值，见表2。

表2 GH1基因上的10个SNPs位点的遗传参数分析

2.2 不同SNP位点与性状关联分析

利用SPSS软件统计各基因的不同SNP对应的表型（体长、体高和体重）的平均值及标准误差，详细结果见表3。利用SPSS中的一般线性模型对各基因的SNPs位点与表型进行关联分析，GH1基因外显子1、2、3、4检测到10个SNPs位点，每个位点均只有2种基因型。一般线性模型的主体间效应检测结果显示，所有SNP位点基因型与表型（体长，体高和体重）均未有显著差异。

表3 突变位点与生长性状的关联性分析

3 讨论

动物的生长性状是一种复杂的数量性状，个体大小由遗传、环境、饲养条件等因素相互作用而决定。对这些复杂的数量性状来说，单基因的突变、关联基因上的SNP变化是引起个体大小差别的遗传基础［9］。SNP是畜禽DNA序列中最常见的一种突变形式，其对性状的功能和作用机制解析是当前基因组学研究的热点之一。GH1基因属于矮小基因。GH1基因是IGHD（特发性生长激素缺乏症）中研究最深入的基因［10］。GH1基因突变患者表现为GH缺乏或减少，GH功能严重丧失，表现身材矮小、生长迟缓、骨骼成熟延迟［11］。Curi等［12］研究结果显示，GH1基因多态性的ll基因型与牛屠宰时的增重和体重显著相关。Cheng等［13］研究揭示，GH1基因的多态性与猪体重明显相关。Pal等［14］研究表明，GH1基因的突变影响蛋白质结构的稳定性，导致杂交牛的生长，繁殖和产奶量减少。本研究对检测到的海南黑山羊GH1基因的10个SNPs位点，其基因型与生长性状（体长、体高、体重）关联性分析显示，差异并不显著，可能与检测样本数量和群体分布有一定关系，本实验采集的样本来自本所种羊的一个保种场，长期圈养、近交等因素导致群体性状趋于一致。