CRISPR技术在蚊媒传染病防控中的应用

陈 峰 唐晓宇 南通海关综合技术中心（江苏，南通，226005）

随着“一带一路”倡议的推进，蚊媒传染病从国外地区传到内地的几率越来越大。在我国境内产生传播、在局部地区形成流行性病例的风险也越来越大，在极大程度上威胁到人类健康与社会发展。我国曾自按蚊、库蚊与伊蚊内提取出很多不同的虫媒病原体，自动物与人类血清内检出了不同虫媒病原体的抗体，也发现了多个输入性病例；蚊类最强活动阶段，出现了病毒性脑炎与原因不清的发热病例，可见，尚未探明的未知虫媒病原体可能存在于蚊类体内，为此检测水平的提升尤为重要。截止当前自蚊类体内已检出了将近300种的病原体，就世界各地而言，每年蚊媒传染病可导致巨大疾病压力的产生。近年来，由于科技的飞速发展，基因编辑技术开始应用蚊媒传染病研究方面［1］。基因修饰主要采取以真核转录因子为基础的ZFN（锌指核酸内切酶）和转录激活因子样效应物核酸酶2种技术，但这2项技术因复杂的设计、较低的效率等缺陷使得其相对局限，不能实现广泛推行［2］。CRISPR技术的出现始自20世纪90年代，其在生物化学实验中的首次应用是在7年后，随即于极短时间内成为许多领域（如微生物学、农业与人类生物学等）应用最为广泛的一类基因编辑工具［3］。利用CRISPR技术可以实现病毒自身基因向细菌的整合，借助细菌的细胞工具来服务于病毒基因复制，为了有效清除来自病毒的入侵基因，细菌完成了CRISPR-Cas9系统的进化，其能够利用此系统轻易地切除掉侵入自身基因组的病毒基因，此免疫系统只存在于细菌中［4］。CRISPR技术通过基因编辑实现对生物DNA序列的添加、修剪、替换、切断操作，从而改变生物体的某些特性［4］。CRISPR技术的开展为蚊虫生理、生化、发育、宿主同病原体间的联系等多个方面的基础性分子生物研究配备了靶标特异性的修饰工具，为蚊媒传染病控制技术的提升开辟出新路径。

1 CRISPR技术研究现状

1.1 CRISPR技术简介

以目前应用最广泛的发现于化脓型链球菌中的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统为例，其由下述3部分构成：其一为特异性的CRISPR相关RNA（即“cr-RNA”）；其二为反式激活的crRNA （即“tracr-RNA”）；其三为CRISPR相关的核酸内切9（即“Cas9”）［5］。此外，之后的相关学者实现了内含靶向指导序列的crRNA向tracrRNA内有效融合，从而建立了单链导向RNA（即“sgRNA”），可以代替cr-RNAtracrRNA复合体，为Cas9核酸内切酶对双链DNA进行定向切割提供指导［6］。总体来说，CRISPRCas反应由下述3个阶段构成。（1）第一阶段，属于适应阶段。此阶段，蛋白复合物Cas1-Cas2切除目的DNA序内的Protospacer（原型间隔子），同时完成此Protospacer向5’末端的CRISPR重复序列的插入，由此得到1个新的间隔子［7］；（2）第二阶段，属于表达与加工阶段。此时，CRISPR序列和前一步骤所得新间隔子联合转录，得到前体crRNA （Precr-RNA），同时借助特殊的Cas9加工成成熟的crRNA；（3）第三阶段，属于干扰阶段。此时，crRNA结合Cas9蛋白，得到复合体，能够对PAM（原型间隔序列毗邻基序）前的靶点序列进行识别，活化Cas9内HNH与RuvC结构域，从而具备切割作用，借助此功能可以让DNA双链断开（DSBs），再通过机体相关自我修复途径，诸如NHEJ（非同源末端连接）或HDR（同源修复）等，顺利完成基因组的定点插入、敲除或修饰［8］。

1.2 研究现状

CRISPR所指为内含若干短同向重复的基因座，它的发现来源于已经被测序的细菌基因中。作为原核的适应性免疫系统，CRISPR发挥相应作用，可提供针对入侵的外源核酸的获得性抗性。外源DNA的短片段（即“间隔区”）向CRISPR重复序列内的基因组整合，作为CRISPR元件保留过去暴露的记忆［9］。这些被留作记忆的间隔区通过与真核生物内RNAi相似的途径来识别与沉默外界遗传物质。Cas蛋白（CRISPR相关蛋白）是CRISPR系统内发挥关键作用的一类蛋白质成分。

CRISPR技术的两大豪门实验室分别开发出了一种工具。张锋实验室利用Cas13蛋白的天然RNase活性开发和优化了一种方法，包括SHERLOCK和SHERLOCK v2。Jennifer Doudna的实验室则利用Cas2a的非特异性ssDNA降解开发出另一种称为DETECTR的方法。

检测核酸的时候，大家都希望特异性和灵敏度越高越好。然而，目前的检测方法要么缺乏灵敏度，要么缺乏特异性，要么太贵太复杂，总之，缺点一大堆。好在，科学家近日利用Cas9蛋白的变体Cas13和Cas12a开发出简单又便宜的平台，能够可靠检测低水平的核酸。

SHERLOCK和DETECTR分别利用Cas13和Cas12a对邻近ssRNA和ssDNA的切割和降解来切割和激活报告基团，随后对这个报告基团产生的信号进行测定，即可确定感兴趣的DNA、RNA或突变是否存在。这两个系统都证实了CRISPR在诊断上的潜力。

2 蚊媒传染病常用检测方法与CRISPR技术对比分析

2.1 蚊媒传染病病毒抗体检测

采用生物医疗公司生产的相关病毒试剂盒检测患者急性期血清中的病毒抗体。该试剂采用胶体金法，具体原理为：蚊媒传染病病毒抗体分别预先包被在试剂条上，可捕获蚊媒传染病病毒抗体，与胶体金复合物（包含多型蚊媒传染病病毒异性抗原）结合后如为阳性即可显色。

抗体检测是判断是否感染蚊媒传染病的间接证据。依据血检测的要求，用于血清检验的样本比较容易收集，而且在收集过程中注意规范就可以得到高质量的标本，这个过程便捷快速，对检测人员来讲也更加安全，不容易被感染。抗体是病人体内受到病毒刺激后而产生的物质，为是否感染的间接证据。

2.2 蚊媒传染病患者血清RNA检测

蚊媒传染病病毒RNA检查采用逆转录PCR法，也被称为核酸检测。测定试剂盒主要选择荧光定量PCR技术，首先将蚊媒传染病病毒（RNA结构）转变为稳定的DNA结构。RNA结构不稳定，通过逆转录酶和DNA原料的作用，完成RNA逆转录，两条链分开，生成包含病毒信息的DNA单链结构［10］。然后进行PCR扩增。整个检测的核心就是让DNA不断自我复制，探针与DNA结合时，荧光结构被抑制不发光；然后，DNA在聚合酶的作用下，开始自我复制，荧光结构脱落，开始发光。为了确保能够探测出荧光信号，一般循环设定为40次。在不存在病毒的检测对象中，经过逆转录不会产生靶基因的扩增，所以检测结果是荧光信号正常，不会出现增强的现象。

蚊媒传染病也存在潜伏期和窗口期，只不过比较短，人体在感染之后，经过病毒的繁殖以及自身免疫系统的作用，要经过3-7d左右才会在患者体内生产抗体，这样才会被检测出来。在蚊媒传染病病毒侵染患者的时候，最先在人体内存在的是蚊媒传染病病毒的RNA，利用血清检测是无效的，只能依靠PCR的方法进行排查和筛选，在病毒RNA出现之后一段时间人体才会产生IgM抗体，这种抗体可以使用间接法进行检测。目前对病毒的检测都依靠试纸进行检测，检测的对象就是抗体，这种方法无法避免窗口期和潜伏期的风险［11］。因此可以知道常规性的检测手段在检测蚊媒传染病的过程中容易检测失效，这是一个很大的缺点。而利用逆转录PCR法进行检测，能够准确地查出病毒核酸是否存在于患者体内，并给出可信的诊断结果，相比于其他方式灵敏度是最高的。

2.3 CRISPR技术检测

CRISPR技术检测是将Cas12a酶和CRISPR RNA（crRNA）结合，构成一个复合体。当crRNA与病毒RNA上的特异性序列相结合之后，能够激活Cas12a酶［12］。Cas12a酶被激活后，能够对附近的单链RNA分子进行切割，研究人员同时在RNA上添加荧光分子，当RNA被切断后，会释放出荧光信号。此时，对荧光信号进行捕捉，就能检测到病毒特异性序列的存在［13］。以前基于这一原理的CRISPR检测为了提高检测的灵敏度，会通过PCR扩增技术扩大样本量。而这款检测技术并不需要RCR扩增的过程，就可以直接定量检测样本中的病毒RNA水平，大大缩短了检测时间。蚊媒传染病检测对于控制疾病传播、及早诊断治疗具有重要意义。荧光定量PCR由于高灵敏度和特异性成为了蚊媒传染病检测的金标准。由于设备昂贵、操作繁琐，荧光定量PCR技术很难用于现场即时检测。所以，研究人员一直致力于研究如何将CRISPR基因编辑法应用于蚊媒传染病的检测中，提高蚊媒传染病的检测时间［14］。经过多年的研究，目前CRISPR技术检测已经成熟并且运用广泛，CRISPR法检测过程易于操作，需求的材料仅仅是提纯之后的核酸，检测步骤只有简单的3个环节，检测结果能够在1h内出来，十分便捷快速。

3 基于CRISPR技术的蚊媒病毒检测存在的问题

相对于传统的PCR技术，基于CRISPR技术的蚊媒病毒检测技术具有更高的灵敏度，更好的特异性，而且不依赖于昂贵装置以及操作者的专业性，方便快捷，成本低廉，因此成为生物检测领域的耀眼新星。然而，目前所使用的基于CRISPR技术的蚊媒病毒检测技术还存在一些不足，主要体现在以下方面：

3.1 基于CRISPR技术的蚊媒病毒检测技术一般需使用RNA荧光报告探针，但RNA容易降解，致使可能出现假阳性的检测结果［15］。

3.2 DNA或RNA的有效获取是核酸检测的基础，简便快捷无需依靠仪器即可有效获取DNA或RNA，是CRISPR技术在蚊媒病毒检测中即时应用的保障，因此，需要进一步开发针对植物或动物组织DNA或RNA的简便获取技术。

3.3 由于单独使用Cas12检测的灵敏度偏低，基于CRISPR/Cas12的核酸检测技术一般需要2个反应步骤，第一个步骤是扩增反应，第二个步骤是将扩增的样本加入到包含Cas12蛋白和其他反应试剂的试管中进行检测反应，这不但增加了检测流程的复杂性，而且样本在转移步骤中可能被污染。因此，需要进一步开发更为简便的检测手段，让扩增RNA或DNA的步骤和Cas12蛋白检测的化学反应能够在同一个试管中进行，或挖掘更多新型Cas并建立更为简单高效的无需扩增的CRISPR/Cas检测方法。

4 展望

基于CRISPR系统的蚊媒病毒检测的灵敏性和特异性非常突出，已经达到amol/L甚至zmol/L的范围，并能检测点突变，这必将在核酸测定方面起到非常关键的作用。对于检测速度，最快的分析至少需要15 min，以后可以通过鉴定新的Cas蛋白和工程改造已存在的Cas蛋白，以及优化信号放大系统，以进一步提高检测速度。CRISPR技术的蚊媒病毒检测技术使用了无需核酸提取的病原体检测（HUDSON）、等温扩增以及试纸条检测，为了检测更加便捷，今后应发展一步诊断法，包括病原体核酸释放、预扩增、CRISPR-Cas诱导反应和信号读出等。未来还可以将人工智能（artifificial intelligence，AI）与CRISPR-Cas13诊断测试相结合，构建一个快速、准确和更智能的感染性病原体诊断预警系统。随着CRISPR/Cas系统在细菌、古菌和细菌大病毒中的不断发现，基于CRISPR/Cas系统的核酸检测技术得以不断丰富发展。如CRISPR基因编辑先驱蛋白Cas9，失去切割活性的变体dCas9也可被固定在石墨烯纳米材料上，成为核酸检测芯片。Cas phi是新近发现的具有功能的最小分子量的Cas12类蛋白，识别和切割dsDNA被激活后，同样具有ssDNA附带切割活性。因此以CRISPR/Cas系统为基础的核酸检测技术，必将弥补以PCR为基础的传统核酸检测技术的不足，可显著促进诸多领域的发展，包括食品、农业以及医学等。