测序技术在葡萄与葡萄酒研究中的应用

魏晓峰，李波廷，廖晨希，李贤哲，梁善杰，鞠延仑*，房玉林*

（西北农林科技大学葡萄酒学院/陕西省葡萄与葡萄酒工程研究中心，陕西 杨凌 712100）

DNA测序技术（DNA sequencing technology）是分子生物学发展历程中一个重要转折点，它能够将基因组DNA上的遗传信息真实准确地反映出来，让我们了解到微生物、植物、动物及人类的全基因组序列，从而较全面地揭示基因组的复杂性和多样性。因此测序技术在当今的科学研究中扮演着重要的角色，为现代农业科学、食品安全等领域的科技进步起到巨大的推动作用[1]。

DNA测序技术是指测定DNA序列的技术，即获取DNA一级序列腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）四种碱基排列组合的方式。在分子生物学研究中，研究和改造目的基因的基础是对DNA的序列分析。用于测序的技术主要有SANGER等发明的双脱氧链终止法和MAXAM与GILBERT发明的化学降解法，目前“SANGER法”得到广泛的应用。同时DNA测序技术发展迅速，已经由第一代测序技术发展为第二代测序技术，并逐步开始向第三代测序技术拓展[2]。

葡萄和葡萄酒与人们的生产生活密不可分，健康和诱人的口感及商业价值等实际需求促进其发展。测序技术在葡萄与葡萄酒中的应用和研究意义重大，目前已有的研究将测序技术与葡萄品种、葡萄种植环境、酿酒微生物及酒中芳香物质[3-7]研究结合，取得显著成果。现就测序技术在葡萄与葡萄酒研究中的应用情况进行介绍，旨在促进测序技术与食品科学研究的融会贯通及长远发展。

1 测序技术及其发展历程

1.1 第一代DNA测序技术

第一代测序技术（SANGER法）是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。均一的单链DNA分子是一代DNA测序实验的起始材料，依次通过变性、退火、延伸三个阶段，利用DNA聚合酶，通过碱基互补的原理得到DNA的碱基序列[1-5]。传统的双脱氧链终止法、化学降解法以及由此衍生出的各种DNA测序技术均称为第一代DNA测序技术，人类基因组计划便是基于第一代测序技术而开展，目前的荧光自动测序仪的原理也基于此而诞生[6]。

1.2 第二代DNA测序技术

第二代测序技术利用聚合酶链式反应克隆阵列[8]，进行引物杂交和酶延伸反应，每个延伸反应所掺入的荧光标记的成像检测能同时进行，从而获得测序数据[9]。第二代测序技术的单次测序容量达到了几十万甚至几百万条，使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行[10]，因该技术具有良好的性价比，使其成为目前最常使用的高通量测序技术。

1.3 第三代DNA测序技术

第三代测序技术是指单分子测序技术，是以单分子测序为主要特征，实现对每一条DNA分子单独测序。Pacific Bioscience的单分子实时测序（SMRT技术）、He-licos单分子测序仪和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的纳米孔测序仪正朝着低成本、高通量、长读取的方向发展[11]。第三代分子测序技术的显著特点是不依赖二代测序中的聚合酶链式反应（PCR）扩增，基于边合成边测序的思路，每次测序只加入一种脱氧核糖核苷酸，随后将未参与合成的DNA聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）洗脱，直接对Cy3成像并观测荧光信号，然后化学裂解核苷酸上的燃料并释放加入下一种脱氧核苷酸和聚合酶的混合物，进行下一轮反应[12-13]。第三代测序技术对于碱基的测定准确率较高，可达90%左右。因此，随着生物信息算法的逐渐完善，第三代测序技术有望很快投入市场。

2 测序技术在葡萄与葡萄酒领域的应用

葡萄是世界上最古老的果树树种之一，被誉为世界4大水果之一，可用于生食、制干及酿酒等。在葡萄种植到加工过程中经过多道环节，每一环节不同机制均会影响葡萄及其加工产品品质。如种植环境中土壤水分[14]相对含量高低；土壤微生物对葡萄品质的影响[15-18]；葡萄生长过程中低温对葡萄代谢功能的影响[19-20]；以及葡萄采摘后保鲜技术等。测序技术在葡萄与葡萄酒的研究中也有较为广泛的运用。

2.1 测序技术在葡萄中的应用

2.1.1 葡萄种植环境研究中的应用

葡萄种植土壤的综合性质对葡萄品质有很大影响，以土壤中微生物的多样性和分布规律、土壤中相对含水量及耕作方式三个方面进行探讨，阐明测序技术在分析土壤微生物中的优势。

史芳芳等[15]为了解新疆兵团十二师不同葡萄种植区根基土壤真菌群落多样性，以新疆6个不同区域葡萄根基土壤样品为试验材料，对土壤真菌18s RNA V2区进行高通量测序，结果表明同一产区不同区域之间土壤微生物含量大不相同，且具有多样性。魏玉洁等[18]通过高通量测序技术证明无论是真菌还是细菌，在土壤中的种类最为复杂、数量最多，其次是葡萄叶片和酿酒葡萄。宋雪洁等[17]对不同土层细菌16s rDNA进行高通量测序，表明从10～70 cm土层的微生物数量逐渐减少。王晓雯[16]通过Illumina Hiseq高通量测序分析发现，变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）为优势细菌类群，子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）为优势真菌类群。这两组实验均说明不同土壤深度之间微生物仍具有多样性和结构差异，且微生物种群的分布同样有规律可循。在土壤相对含水量对葡萄果实作用机制方面，李倩等[14]通过对转录组测序发现，适当的土壤水含量会提高酿酒葡萄‘北红’‘北玫’PAL及CHS等基因表达量。测序技术为土壤微生物的多样性，分布等研究提供便利。

2.1.2 葡萄品种研究中的应用

不仅土壤中富含微生物，葡萄果皮表面也富集微生物，因此测序技术在分析葡萄表皮微生物多样性方面也有建树。葡萄品种改良[21]、香气物质及其性状分析及果实内营养物质的合成机制都可以用测序技术为其研究提供帮助。

葡萄酒的酿造是多种微生物参与代谢的过程。作为葡萄酒原料，酿酒葡萄自身携带的微生物理所当然成检验对象。张世伟等[22-23]应用高通量测序技术，分析沙城地区不同品种酿酒葡萄表皮的微生物群落，发现‘雷司令’的真菌及细菌丰富度均为最大，由此推测酿酒葡萄上的微生物会对植株、果实及葡萄酒酿造产生诸多的影响。在葡萄香气研究中，孙婷等[24]采用全基因组重测序技术构建‘红地球’与‘着色香’葡萄的高密度遗传图谱，对草莓香型葡萄特征香气物质进行数量性状位点（QTL）定位研究。程程等[25]结合基因重组测序进行全基因组关联分析，发现了一些与葡萄果实挥发性香气物质相关的候选基因及单核苷酸多态性（SNP）定位。而刘翠霞等[26]则对玫瑰香香味进行了研究，采用测序基因分型（GBS）简化基因组测序技术，分别构建‘北丰’和‘3-34’品种的高密度遗传图谱，对玫瑰香味性状进行QTL定位，结合RNA-seq技术，初步筛选出与玫瑰香香味物质合成有关的候选基因。由此可见，测序技术可为选育具有特定风味的葡萄品种研究提供有效途径。

同时，外部环境对葡萄生理代谢的影响、破眠剂处理方式对果实发育的影响等方面也可应用测序技术。梁国平等[19]通过研究抗寒性较强的山葡萄，对其在不同温度环境下的5个时期做了转录组测序，发现v-myb禽成髓细胞病病毒癌基因同源物（MYB）转录因子富集到的差异基因数量最多，其次是基本螺旋环螺旋（bHLH）转录因子，而富集到最少的转录因子为维管植物单锌指（VOZ）和LEAFY（LFY）。张博等[20]在低温胁迫处理后不同时间点进行转录组测序后发现，同一品种在低温胁迫下，时间越长与对照组差异基因越多。

在破眠剂处理方式对葡萄影响的研究中，刘芳等[27]以当年生‘夏黑’葡萄枝条的单芽枝段为试材，取2.5%单氰胺处理15 d的休眠芽进行转录组测序，发现差异基因主要集中于光合作用、淀粉与蔗糖代谢、脂肪酸代谢、植物激素信号转导和苯丙素生物合成等作用通路。此外，测序技术在其他方面也有广泛应用，如在遗传及品种培育方面，李贝贝等[21]利用简化基因组测序技术，开发出大量可用于群体遗传分析的SNP标记，为后期进一步研究葡萄起源进化提供参考。

2.1.3 葡萄常见病害及保鲜研究中的应用

在葡萄生长发育过程中会遇到病害的侵扰，分析病害并提前预防，发现病害及时救治变得紧急而重要。在病毒多样性及其检测[28]、病毒产生机制及其影响等方面，测序技术都做出重要贡献，同时，基于测序技术研究的葡萄保鲜技术也愈加成熟。

中国报道的葡萄病毒病已有14种，葡萄病毒病的发生严重影响我国葡萄产业以及一系列延伸产业，所以对葡萄病毒病的认识和防治显得尤为重要。张向昆等[29]对秦皇岛产区葡萄卷叶病毒3（GLRaV-3）和灰比诺病毒的分离物进行基因序列分析，结果表明GLRaV3-QHD分离株与已报道分离株的HSP70基因核苷酸序列同源性在96.3%～99.3%；GPGV3-QHD分离株与已报道分离株的MP基因核苷酸序列同源性在93.3%～98.4%。于翠等[30]利用小RNA深度测序技术从新疆葡萄上检测出8种病毒。李斯琪等[31]以葡萄花叶病毒为研究对象，利用siRNA测序和RNAseq高通量测序明确该病害病原物种及分子类型，并对其分子特性进行分析研究，结果表明葡萄花叶病害由6种病毒复合侵染导致。在病毒产生机制及其影响方面，彭军波等[32]通过高通量测序技术，揭示葡萄溃疡病菌引起对葡萄的侵染适应性和葡萄-溃疡病菌互作的组学基础。

张眉等[33]对葡萄霜霉病进行遗传特性的研究发现，有些地方菌株亲缘关系十分密切，而有些菌株却未体现亲缘性。在葡萄病害抑制方面，冯娇等[34]发现赤霉素和氯吡脲显著抑制苯丙烷及类黄酮合成相关基因表达，进而降低果锈生成路径中相关酶的活性，从而抑制葡萄果锈的生成。殷向静等[35]运用转录组测序技术对‘通化3号’和塘尾葡萄果实葡萄白藜芦醇含量差异的分子机理研究，表明不同芪合成酶基因启动子中含有的顺式作用元件的种类和分布不同，对不同激素处理的响应也有差别，进而导致芪合成酶基因产生有差异的表达模式。

2.2 酿酒微生物及发酵过程研究中的应用

葡萄酒发酵的过程是一个多种微生物共同作用的过程，并涉及多个环节，其产品具有极高的饮用和商业价值。测序技术的运用对于酿酒微生物、葡萄酒发酵过程以及成品口感等方面的研究具有重要意义[36-37]。

2.2.1 酿酒微生物测序及选育

酿酒微生物种类繁多，除了有益于葡萄酒酿造的微生物，也有如布氏菌（Brettanomyces bruxellensis）等易引起葡萄酒变质的细菌。Megan等[38]对一批布氏菌感染的葡萄酒进行基因组测序，鉴定大约3000个基因，其产物平均49%的氨基酸与酿酒酵母原生质一致，由此可以推测病菌的生长来源。选择优良酿酒微生物对葡萄酒品质的提升大有作为。魏玉洁[39]等对新疆3个产区的土壤、葡萄果实和叶片、葡萄汁及葡萄酒进行研究，发现葡萄园地理位置不同，微生物的多样性也存在差异。由以上研究可见，测序技术在探明酿酒微生物多样性、作用机制以及选育方面具有重要意义，为辨别有益无益菌株，优质酿酒微生物的筛选等工作提供极大地帮助。

2.2.2 酿酒微生物的影响因素研究

外界影响因素如低温及施药均会对酿酒微生物产生影响。葡萄低温发酵作为现代葡萄酒创新工艺，其优点在于能优化葡萄酒品种，丰富葡萄酒香气。但较低的温度会影响葡萄酒的正常发酵，所以对酿酒酵母的低温耐受性研究具有重要意义。冯莉等[40]以我国本土酿酒酵母为研究对象，利用全基因组测序技术与分离群体分组分析（BSA）相结合的QTL定位等方法，发现NAT1和YOR365C是影响酿酒酵母低温耐受性的主要基因。其中NAT1基因与蛋白质的乙酰化修饰过程有关，YOR365C参与细胞壁的合成。此外，化学农药的使用也会对自然发酵葡萄酒中的酵母菌群落结构产生较大的影响，许维娜等[41]采用分离培养、常规分子生物学鉴定和Illumina MiSeq宏基因组测序结合的方法研究发现，未使用内吸收性化学农药的葡萄样品自然发酵液中鉴定出的酵母菌高于使用常规化学农药的葡萄样品自然发酵液。

2.2.3 发酵方式及处理过程的研究及应用

不同的发酵方式会对葡萄酒中微生物的多样性、挥发性风味物质及其中的化学成分产生影响，同时不同阶段的处理方式也会对葡萄酒的品质产生影响，利用测序技术可以更好地分析控制其中的各个环节[7,42]。董画等[43]以吉林长白山地区山葡萄为试材，利用高通量测序技术分析发现自然发酵和控制发酵在主发酵阶段差异微生物为酵母属和孢汉逊酵母属，后发酵阶段还有掷孢酵母属。

代晨曦等[44]以石河子张裕巴保男爵酒庄的‘赤霞珠’葡萄为原料，在苹果酸-乳酸发酵开始后取不同时间点的样品进行高通量测序以分析发酵过程中乳酸菌的多样性，结果共检出594种不同属微生物，并经过α、β多样性分析，结果表明，不同时间点、细菌群丰富度和多样性不同，且与起始期相比差异较大。而在目前葡萄酒生产中启动并主导完成苹果酸-乳酸发酵的主要微生物是酒酒球菌，对其自身基因、基因转化表达及多样性的研究均具有极高的价值[45-46]。

3 总结及展望

随着DNA检测技术的不断更新换代，检测技术由难到易，由繁杂到简易，从低通量到高通量测序，从PCR技术扩增DNA片段到单分子边合成边测序。测序技术有了跨时代的改变，逐渐降低的成本费用使先进技术更容易应用推广。

总结测序技术的发展及其在葡萄和葡萄酒领域的广泛应用，旨在为相关研究人员提供借鉴，加强对测序技术的认识，并期望能对今后的研究有所启发。未来应该注重以下几个方面的研究：（1）通过基因的核酸序列，鉴定新的基因，为相应的蛋白序列及功能研究提供捷径；（2）通过测序技术获得更多的基因多态性等信息，绘制遗传图谱，使进化关系的理解更为透彻，从而促进了对生物多样性的研究；（3）通过高通量测序技术提高实验技术的准确性。