烟酰胺N甲基转移酶在食管癌中的表达及机制研究

周嘉梁，吴 佳，黄建锋，范 强，赵涤非

（江南大学附属医院肿瘤放疗科，江苏 无锡 214122）

根据2018年全球癌症数据统计发现，全球2018年癌症约有1 810万 例新发病例，960万 例死亡病例，其中食管癌发病例数约为57.2万 例，排第7位，死亡例数约为50.8万 例，排第6位[1]。全球食管癌发病率最高的是东南亚、东亚地区，特别是我国的食管癌发病率在全球排前五。目前食管癌的发病机制不明确，因此提高食管癌的筛查技术，特别是肿瘤标志物的发现对于食管癌的高效筛查具有重要促进作用[2]。烟酰胺N-甲基转移酶（nicotinamide N-methyltransferase, NNMT）是一种催化烟酰胺的N-甲基转移酶，能够转化机体内的药物及外源性化合物。研究[3-5]发现NNMT在心脏、肾、胎盘等正常组织中低表达，而在肾癌、肝癌、胃癌、甲状腺癌组织中高表达，且高表达的NNMT可能成为肿瘤预后及治疗的有效预测因子。因此本研究推测NNMT在食管癌中也存在异常表达，并参与食管癌的发生和发展，为证实此推测，本研究将通过免疫组化检测本医院食管癌患者中NNMT表达，并探讨NNMT对EC9706食管癌细胞增殖、侵袭的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1 标本来源 本研究标本取自2015年11月—2019年12月江南大学附属医院经手术切除、并经病理确诊为食管癌的84 例石蜡标本，所有患者均有完整的临床资料及随访资料，所有患者在术前均没有接受过任何的化疗，放疗及生物治疗等。男73 例，女11例；＜60 岁18 例，≥60 岁66 例，年龄43～74 岁，中位年龄62.6 岁。另外选取84 例相应的距离癌组织＞4 cm 的正常组织作为对照。

1.2 试剂与仪器 EC9706食管癌细胞购于上海细胞库。DMEM培养基，胎牛血清购于美国Gibco公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、CCK-8试剂盒、Hoechst染色试剂盒均购于南通碧云天生物技术有限公司；兔抗NNMT、Wnt1a、β-catenin、CyclinD1、MMP-9及甘油醛-3磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体购于美国Abcam公司；Multiskan FC酶标仪购于Thermo Fisher公司；CFX Connect™实时荧光定量PCR仪购于伯乐生命医学产品（上海）有限公司；ChemiDocTMXRS凝胶成像系统购自美国伯乐公司。

1.3 免疫组化法检测NNMT表达 石蜡标本包埋并切成5 μm厚度的切片，60 ℃烘烤后，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡，梯度酒精脱水，微波炉加热进行抗原修复，3% H2O2内源性灭活，切片滴加NNMT一抗工作液、4 ℃孵育过夜，次日滴加生物素二抗工作液室温孵育1 h，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片，光镜下观察蛋白染色情况。选取PBS溶液代替一抗作为阴性对照。NNMT阳性细胞主要定位于细胞浆，采用半定量积分法对染色结果进行判定[6]。

1.4 CCK-8法检测细胞活力 将EC9706食管癌细胞接种于96孔板，培养24 h，转染siRNA NC（对照组）及siRNA NNMT（siRNA组），每组设3个复孔，培养48 h，加入10 μL CCK-8溶液，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养1 h，取出培养板，于酶标仪波长450 nm处测定各复孔的吸光值。

1.5 Hoechst法检测细胞凋亡 将EC9706食管癌细胞接种于96孔板，培养24 h，转染siRNA NC及siRNA NNMT，每组设3 个复孔，培养48 h，去除培养基并PBS洗涤3 次后，加入固定液固定10 min，PBS洗涤3 次，Hoechst染液染色15 min，PBS洗涤3 次，荧光显微镜下观察。

1.6 Transwell法检测细胞侵袭能力 无血清DMEM培养液稀释Materiel胶，并以400 μL/孔均匀平铺于Transwell上室，去除气泡，并于培养箱中孵育30 min待其凝固备用。将处于对数生长期的细胞消化、计数，并取2 mL浓度为5 ×104个/mL的细胞于Transwell上室，Transwell下室加入3 mL含10%胎牛血清的细胞培养液，Transwell板于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h，将上室取出，用棉签将膜表面残留擦去，吸取培养液，并用PBS清洗，甲醇固定20 min，0.1%结晶紫染色20 min，PBS洗涤，显微镜下观察并拍照记录，取4个视野细胞数平均值。

1.7 Realtime PCR法检测NNMT mRNA含量 按照Trizol试剂盒提取RNA，紫外可见分光光度计测定mRNA浓度和纯度，后根据HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，在荧光定量PCR仪上进行检测，以GAPDH为内参，计算出各组NNMT mRNA的相对表达量。

1.8 Western blot检测NNMT、Wnt1a、β-catenin、CyclinD1、MMP-9表达 二奎啉甲酸法（BCA）试剂盒测定细胞蛋白浓度，并制定蛋白标准曲线。制作8%浓缩胶及12%分离胶。蛋白样品煮沸变性后，取30 μg上样，进行浓缩及电泳分离，分离电压120 V，湿法转聚偏氟乙烯（PVDF）膜。2% BSA室温封闭1 h，一抗工作液（兔抗人NNMT、Wnt1a、β-catenin、CyclinD1、MMP-9及GAPDH多克隆抗体，稀释度：1:500）4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H＋L）稀释度1:1 000）室温孵育1 h，加入化学曝光液后，在凝胶成像系统中曝光，并根据Quantity one软件分析电泳条带灰度值。

1.9 数据分析 所有数据应用SPSS 17.0软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NNMT在食管癌及癌旁正常组织中的表达NNMT在食管癌组织（59/84，70.23%）中的阳性表达显著高于癌旁正常组织（4/84，4.69%）（χ2＝76.825，P＜0.05）。

2.2 siRNA NNMT转染效果的检测 Realtime PCR实验结果表明：与对照组比较，siRNA组NNMT mRNA表达量下调[(0.56±0.05) vs (1.00±0.10)，t＝5.903，P＜0.05]。Western blot实验结果表明：与对照组比较，siRNA组NNMT蛋白表达量下调[(0.74±0.07) vs (1.56±0.16)，t＝7.321，P＜0.05]。

2.3 siRNA NNMT对EC9706食管癌细胞活力、凋亡及侵袭能力的影响 CCK-8实验结果表明：与对照组比较，siRNA组细胞活力降低[(0.39±0.04)vs (0.62±0.06)，t＝5.832，P＜0.05]。Hoechst染色结果表明：与对照组比较，siRNA组细胞凋亡率提高[(32.46±3.24)% vs (3.31±0.32)%，t＝6.431，P＜0.05]。Transwell结果表明：与对照组比较，siRNA组细胞侵袭数目减少[(32.47±3.25) vs(189.32±18.90)，t＝6.321，P＜0.05]。

2.4 siRNA NNMT对EC9706食管癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达量的影响 Western blot实验结果表明，与对照组比较，siRNA组Wnt1a[(0.41±0.04) vs (0.15±0.01)，t＝5.842，P＜0.05]、β-catenin[(0.34±0.03) vs (0.17±0.02)，t＝5.216，P＜0.05]、CyclinD1[(1.12±013)vs (0.39±0.04)，t＝6.438，P＜0.05]、MMP-9[(0.87±0.09) vs (0.31±0.03)，t＝5.128，P＜0.05]表达量均下调。

3 讨论

NNMT基因最早被学者通过cDNA技术在肝组织中鉴定出来，并位于11号染色体，有3个外显子和2个内含子构成，总长度约有16 500 bp。NNMT主要位于细胞质中，且在正常情况下高表达于肝脏组织中，而在心、肺、肾等其它组织中低表达。NNMT是体内重要的甲基化酶，能够参与多种药物和外源化合物在肝脏组织中的生物转化，对肝脏的解毒功能起重要作用。近些年来研究[3-5]发现NNMT在肾癌、肠癌、甲状腺癌等肿瘤组织中高表达，可能成为肿瘤诊断新的标记物。Xu等[7]研究结果证实胰腺癌癌组织中NNMT表达量高于癌旁组织，Pozzi等[8]实验结果表明NNMT在膀胱癌组织中活性显著上升，Song等[9]研究结果表明NNMT在结肠癌组织中高表达。说明NNMT可能作为癌基因参与多种肿瘤的发生发展。本研究采用免疫组化检测84 例食管癌组织及癌旁正常组织的NNMT表达，结果表明癌组织中NNMT阳性率显著高于癌旁正常组织，与NNMT在其它肿瘤组织中的表达趋势一致[7-9]，从而说明NNMT可以作为癌基因参与食管癌的发生和发展。

另外有众多学者[10-11]发现NNMT表达量的改变对于肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响极为显著。因此本研究继续探讨NNMT对EC9706食管癌细胞增殖、侵袭的影响，结果表明NNMT表达量下调后显著降低EC9706细胞活力，提高细胞凋亡率，减少细胞侵袭数目。肿瘤的增殖、凋亡、侵袭等生物学行为与多种信号通路有关[12-13]。Wnt信号通路在机体的生长发育过程中发挥重要作用，对胚胎形成、干细胞形成、分化过程及细胞增殖等生命过程起调节作用。Wnt信号通路包括经典信号通路及非经典信号通路，前者为Wnt/β-catenin，此信号通路中Wnt1a、3a、7a与卷曲蛋白、LRP5/6形成复合物，后通过一系列信号传递过程，使β-cateinin复合体降解，在细胞胞质中大量积累，并进入细胞核后调控靶基因表达（CyclinD1、MMP-9）。而且Wnt/β-catenin信号通路在包括食管癌中均被异常激活，因此阻断此信号通路成为多种抗肿瘤药物的作用靶点[14-15]。所以本研究继续探讨NNMT下调后对Wnt/β-catennin信号通路相关蛋白表达量的影响，结果表明NNMT下调后能显著地下调EC9706食管癌细胞Wnt1a、β-catenin、CyclinD1及MMP-9表达。

综上所述，NNMT在食管癌组织中高表达，下调NNMT表达量能显著降低EC9706细胞活力及侵袭能力，诱导细胞凋亡，下调CyclinD1及MMP-9表达，与阻断Wnt/β-catenin信号通路有关。后期，我们将进一步行动物荷瘤实验，深入探讨和验证NNMT与食管癌生物学行为及预后的关系，以期能找到新的食管癌预后判断预测因子，并为开发新的有潜力的治疗策略奠定理论基础。