冠状动脉血管生成的机制及治疗分子靶点研究进展

顾宁越，张艳达综述 梁春审校

冠心病(coronary artery disease，CAD)是发达国家人口死亡的主要原因，也是我国患病率急剧上升、医疗费用支出日益增加的一种心血管疾病[1]。其主要病因在于动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)斑块发生发展，造成管腔狭窄或闭塞，引起心肌灌注减少，诱发心肌梗死等临床事件发生[2]。药物治疗和血运重建术极大地改善了冠心病患者的预后，然而，不能耐受手术或手术获益有限的患者，需考虑血管新生治疗。治疗性血管新生(therapeutic angiogenesis)是冠心病药物治疗的新靶点，通过给予生长因子、基因、细胞以促进血管新生，从而达到改善心肌血供的目的[3]。

血管生成过程包括血管新生(angiogenesis)和动脉生成(arteriogenesis)2个阶段。血管新生和侧支动脉生成可以有效代偿心肌缺血，挽救心肌活力。近30年来，治疗性血管新生领域持续探索性研究，然而，在粥样硬化斑块进展阶段，病理性血管新生也曾作为治疗靶点，抗血管生成治疗在动脉模型中取得进展，但进入临床研究后未获得成功。抑制或促进血管新生需要考虑冠心病发展的不同阶段，选择合适的时间窗，才能避免不良事件的发生[4]。

1 冠心病血管新生的机制研究

1.1 冠状动脉粥样硬化斑块内的血管新生 低氧是引起AS斑块内血管新生的基本原因。正常情况下，血液中的氧气可以通过扩散作用从管腔进入血管壁，随着AS斑块的进展，AS核心区域血管壁增厚，炎性反应增强，斑块内的氧耗不断增加，显著减少了氧向内膜的扩散，因此产生不平衡的供氧和需氧状态，导致低氧诱导因子(hypoxia inducible factor, HIF)被激活表达且不断累积[5]。

炎性反应是AS斑块内血管新生的刺激因素。大量炎性细胞可以通过高渗透性新生血管进入斑块内，分泌大量的促血管新生因子，造成局部 “血管新生微环境”，促进该部位的血管新生，炎性反应和斑块内血管新生两者作用相互叠加，会使 AS 斑块更有破裂倾向[6]。

生长因子是AS斑块血管新生的调节因素。最受关注的是VEGF和VEGFR上调，强烈地引起增殖、出芽，内皮细胞管道形成，VEGF激活下游信号通路，转录表达促血管新生的相关基因，如成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)、转化生长因子(transforming growth factor beta, TGF-β)等。FGF是一个重要的促血管生长因子，它促进了内皮细胞和平滑肌细胞增殖，促进毛细血管被周细胞覆盖，以确保血管的稳定和成熟[7]。

从理论上讲，抑制斑块内病理性血管新生可防治斑块破裂，但是，目前抗血管生成药物治疗未在临床试验中获得成功，而抗血管生成药物(主要是抗VEGF/VEGFR)在抗癌治疗中的临床试验显示出心血管不良反应，如引起高血压、心肌缺血和心肌病[8]，提示抗血管生成治疗或许存在一个治疗的时间窗，对严重心肌缺血或高血压的患者是不利的。

1.2 心肌缺血部位的动脉血管新生 缺血缺氧是心肌血管新生的重要刺激因素。AS进展到管腔严重狭窄或阻塞时，冠状动脉血流减少，导致心肌缺氧，缺氧诱导因子-1(HIF-1α)水平随缺氧时间延长而升高，诱导血管新生相关因子如VEGF、红细胞生成素(EPO)等表达增加，启动血管新生级联反应，在大量的血管新生诱导因子中，VEGF是新生血管形成的关键因素[9-10]，它特异地作用于血管内皮细胞，刺激其分裂和增殖，诱导血管新生。

在冠心病患者体内，管径较大的侧支循环比缺血心肌周围小的血管更能起到挽救存活心肌的作用。从血管新生到侧支动脉生成，还需要循环中细胞因子的调控和干细胞的动员。 缺氧诱导HIF-1α和VEGF过表达，启动了血管新生，此后，基质金属蛋白酶(MMP)产生增加，循环中多种促血管新生的基因(如PDGF、ANGPT1、ANGPT2)及促血管新生的趋化因子和受体(如基质细胞衍生因子-1及受体CXCR4，鞘氨醇-1-磷酸及受体)表达上调，促进了内皮祖细胞(EPC)向缺氧部位的募集，促进内皮细胞(EC)的增殖和分裂(调控细胞周期和DNA的基因复制)，募集支持周细胞、平滑肌细胞和基底膜细胞，通过纤维联结蛋白辅助血管稳定性，以完成动脉血管新生。

决定冠状动脉侧支血管开放、扩张的因素还有压力阶差和切应力，冠状动脉狭窄两端的压力梯度是驱动力，导致流体剪应力增大，细胞黏附分子1(ICAM1)和血管细胞黏附分子1(VCAM1)上调，促进了单核细胞的募集，与邻近平滑肌细胞交互作用，产生一氧化氮(NO)及其他促动脉生成分子，激活侧支小动脉内皮细胞和侧支形成[11]。

然而，人们经常观察到血管新生能力被抑制而不是增强，缺血毒性(ischemic toxicity)是血管新生能力受损的重要原因，目前尚未得到充分认识。心肌缺血造成的毒性作用之一是心脏中铜含量的损失(copper loss)。虽然这种缺失的原因尚未阐明，但铜在HIF-1转录活性调控中的重要作用已经明确，即铜不影响HIF-1α在细胞内的表达，但影响对HIF-1转录复合物的形成及其与靶基因中缺氧反应元件的相互作用。补充铜可以刺激HIF-1的转录活性，恢复血管新生能力。认识到缺血毒性并努力克服毒性效应将有助于开发治疗缺血性心脏病的新疗法[12]。

2 冠心病血管生成的分子靶点

自20世纪70年代Folkman提出血管新生的概念，治疗性血管新生经历了VEGF、bFGF单基因导入到内皮前体细胞、心脏干细胞移植不同阶段，对血管新生的认识亦发生了明显变化[13]。近年来，一些小分子化合物靶点、细胞因子调节、内源性祖细胞动员等研究在冠状动脉促血管新生方面有所突破，是极有希望的临床候选疗法，值得深入探讨。

2.1 小分子化合物靶向干预 研究发现许多小分子显示出能够调节缺血环境下的功能性新生血管，如钙蛋白酶、神经肽Y。钙蛋白酶(calpain)是钙依赖性硫醇蛋白酶，其过度表达导致了VEGF介导的新生血管结构和整合异常，DN-calpain-1或calpain抑制剂-1可改善VEGF驱动的血管新生[14]。在饮食诱导代谢综合征猪的慢性心肌缺血模型里，钙蛋白酶抑制剂显示可以改善心肌灌注，增加内皮依赖性血管松弛，减少心肌凋亡，改善氧化应激；钙蛋白酶的下游分子靶点，糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的抑制也有同样的有益作用[15]。

神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)是一种与压力、饮食和脂肪有关的神经递质，它广泛存在于中枢和外周神经系统，也存在于心血管系统供应血管、心肌细胞和心内膜的神经元中，参与包括血管收缩、心脏重塑和血管新生在内的生理过程[16]。饲料诱导代谢综合征和慢性冠状动脉病变的猪模型显示，缺血区注射神经肽Y可改善侧支循环血管生长，增加血管新生，改善心肌灌注和功能[17]。

钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(Calmkii,CaMKⅡ)在缺血性心肌病中被过度激活，越来越多的证据显示，CaMKⅡ的激活可能与VEGF的表达增加有关，在原发性心脏微血管分离的内皮细胞(CMECs)，观察到CaMKⅡ的抑制剂KN93抑制了细胞增殖和内皮细胞迁移，CaMKⅡ对于缺血诱导的冠状动脉血管新生是一个重要的调节因子，它触发了缺血条件下VEGF的表达[18]。

2.2 细胞因子调节 单核细胞活化在FGF和VEGF介导的血管新生和侧支动脉生长中起主要作用。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)通过增加巨噬细胞数量，诱导氧化脂质积聚，加重动脉粥样硬化进展。人类和动物的许多研究都表明，MCP-1及其受体CCR2在动脉粥样硬化和心肌梗死等疾病中的重要性，阻断或沉默MCP-1/CCR2在血管治疗中可能是有用的，然而，这种治疗策略应该谨慎，因为有一些局限性和不良后果[19]。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(G-CSF)注射治疗慢性稳定性冠心病，有效地促进冠状动脉侧支血管生长及改善心肌功能, 但是，G-CSF也能诱导发生急性冠状动脉综合征，临床观察显示其内源性血浆水平升高是心血管事件增加的独立预测因素，使其安全性受到质疑[20]。

2.3 内皮祖细胞动员 越来越多的证据表明，内皮祖细胞(EPCs)可以促进再内皮化，通过替换功能失调的内皮细胞，抑制新生内膜的形成，EPCs目前被认为是内源性血管修复的重要贡献者[21]。有研究观察心绞痛患者行PCI术后EPCs的募集情况，发现PCI可启动EPCs时间依赖性动员, CD34+/KDR+细胞的数量与PCI术后内皮损伤程度密切相关[22]。有3个随机双盲试验比较了自体CD34+细胞移植治疗顽固性心绞痛的临床疗效和安全性，结果显示总运动耐力提高，3、6、12个月心绞痛发作频次下降，24个月病死率明显降低[23]。

研究发现成人深静脉含有血管周围祖细胞，具有克隆形成和促血管新生的潜能，从冠状动脉搭桥手术患者获取隐静脉祖细胞，将大隐静脉的祖细胞与毛细血管内皮细胞建立了N-钙粘蛋白介导的物理接触，移植到免疫缺陷大鼠的下肢缺血模型中，结果显示可促进缺血肢体的新生血管形成和血流恢复[24]。

此外，在急性或持续性损伤部位旁分泌信号可能是体现治疗效果的重要介质。骨髓源性基质细胞(BMSCs)显示组织特异性应答，动态分泌一组保护心脏的生化混合物, 支持了动态多因子旁分泌信号在介导基质干细胞治疗效果中的重要性。研究表明CD133阳性BMSCs有的分泌信号是由不同生物学背景所决定的，包括来自心肌梗死特征的氧化应激损伤心肌细胞的信号，BMSC旁产生的混合因子显示出对氧化应激损伤细胞的高效修复和心输出量的改善[25]。

2.4 基因治疗 心脏基因治疗是一种很有前途的技术。生物工程重组病毒的研发、针对心肌靶向性设计的进展，为治疗提供了有利的条件。在猪心肌缺血模型中，用导管将编码荧光素酶基因的5型腺病毒载体(Ad5Luc，1011病毒颗粒)导入冠状动脉，心肌无局部炎性反应和血流动力学不稳定，缺血再灌注心肌摄取IC-Ad5，证实了IC-Ad5给药方案可用于未来人类基因治疗试验[26]。 在小样本的Ⅰ/Ⅱa期临床研究中，30例顽固性心绞痛患者接受了AdVEGF-D基因治疗，术后3～12 d用放射性PET评价心肌灌注储备(MPR)，随访显示治疗组心肌灌注储备显著增加，AdVEGF-D基因治疗安全可行，耐受性好[27]。在Ⅰ期试验的长期随访研究，31例严重患者缺血区心肌直接注射AdVEGF121作为常规冠状动脉旁路移植术(A组)或微创治疗(B组)的辅助治疗，10年生存率分别为40%和31%，认为腺病毒介导的血管内皮生长因子治疗严重冠心病患者是安全的，未来需要进行更大规模的试验来评估疗效[28]。

2.5 中医药治疗 中医药一直是心血管药理学研究的重要课题，冠心病在传统中医中属于“心痛”“胸痹”范畴，发病病机在于“淤血阻络”，治疗则需“祛瘀生新”。在促血管新生方面中医药有着显著的疗效[29]。麝香保心丸是临床最广泛使用的中成药之一，含有人参皂苷Rb1等活性成分，大鼠心肌梗死模型研究发现，麝香保心丸成药可增加循环EPCs数量和VEGF的表达[30]。中药单体药物如阿魏酸、丹酚酸B可促进VEGF、HIF-α、血小板衍生生长因子表达以达到促血管新生作用。丹参酮ⅡA可减少基质金属蛋白酶-2分泌，起到血管保护作用，黄芪多糖可促进血管内皮细胞增殖和迁移。进一步体外诱导间质干细胞分化为内皮样细胞，单药及联合用药对比发现，丹参酮ⅡA和黄芪甲苷可能通过上调连接蛋白Cx37、Cx40、Cx43表达和增强细胞间隙交互，促进了内皮样细胞的血管生成功能[31]。

3 小结与展望

在过去的几十年里，心血管疾病在介入治疗和药物治疗领域有了巨大的突破。但是，由于心血管疾病人数众多，发病率和病死率较高，缺血性疾病药物治疗新方法将继续改变治疗方式。治疗性血管新生是一个活跃的研究领域，小分子物质的调控、细胞因子和干细胞的应用，对于促进血管新生、侧支血管生长发挥重要的作用，相信今后在临床能够推广。与此同时，运用抗血管生成药物治疗动脉粥样硬化斑块进展的方法虽然符合逻辑，临床前研究也显示了一定的应用价值，但是，临床研究未能获得突破。抗血管生成治疗也存在治疗时间窗的选择，在一些特殊情况下，抗血管生成可能会加重心肌缺血。对动脉粥样硬化斑块损伤部位血管新生机制的进一步研究，将有助于设计出基于功能结构的药物分子以更好的发挥治疗作用。