桑椹花青素合成相关基因的鉴定及其功能研究

王 真

（中国海洋大学，山东青岛 266100）

桑椹营养价值异常丰富，富含大量花青素，对于清除人体自由基、延缓衰老有着十分积极的意义。桑椹果实中大量的花青素由叶绿素转化而来，作为一种黄酮类化合物，桑椹花青素分子当中存有高度分子共轭体系，合成过程比较复杂，众多的结构基因及调控基因参与其中，各种代谢酶是花青素形成的关键，对其基因合成途径进行研究能够实现分子水平的调控，从生物学角度完成果品改良，提升桑椹中的花青素含量，从而创造更多的营养价值以及经济效益。

1 花青素合成途径相关基因研究

1.1 花青素合成途径

第1阶段：在该阶段的苯丙烷途径中，苯丙氨酸作为花色素苷的生物合成前体，是整个合成过程的基础，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）的作用调控之下发生氨基脱去反应，形成反式肉桂酸，在肉桂酸-4-羟化酶（C4H）以及4-香豆酰CoA连接酶的催化作用下，经过一连串的酶促反应而形成次生代谢中间物质香豆酰辅酶A[1]。

第2阶段：该阶段为类黄酮代谢的关键，香豆酸辅酶A与丙二酰辅酶A经由查尔酮合酶（CHS）以及查尔酮异构酶（CHI）的催化作用下形成柚皮素，在黄烷酮-3-羟化酶基因活性的调控之下将香豆酸辅酶A转化为类黄酮母核结构。

第3阶段：该阶段为花青素的初步合成阶段，由多种酶共同参与调控，主要表现为二氢黄酮醇还原酶（DFR）经过催化作用形成无色花色素，再在花青素合成酶（ANS）及双加氧酶（LDOX）的催化调控下完成无色花色素经过氧化脱水实现到有色的过程，同时在类黄酮3-葡糖基转移酶（3GT）的调控下形成结构稳定的花色素苷，形成青素的基本碳骨架[2]。

第4阶段：该阶段为花青素基本碳骨架的修饰阶段，有羟基化、甲基化、糖基化以及酰基化等多种形式，在一个或者是多个点位之间完成，不同的修饰过程完成之后可以形成不同的花色素，经过修饰后的花青素无论在稳定性、光吸收度还是水溶性等方面都得到了明显的提升，花青素苷经过积累以转运谷胱甘肽转移酶（GST）为介质汇集储存于液泡。

1.2 花青素合成代谢基因

1.2.1 花青素合成代谢相关结构基因

（1）查尔酮合成酶基因（CHS）。作为类黄酮合成代谢过程中遇到的首要酶基因，其表达量决定了花青素颜色变化，CHS的关键作用在于催化4-香豆酸CoA与丙二酰CoA合成查尔酮，为类黄酮碳骨架的形成构建基础[3]。作为一个多基因家族，CHS基因编码结构在不同科目的植物之间表现出的保守性较为明显，植物生长过程中CHS缺乏，则会导致类黄酮难以产生。

（2）查尔酮异构酶基因（CHI）。作为类黄酮合成的关键酶，能够完成对类黄酮当中化合物含量的调节，CHI的基因编码是一种功能性单体，其丰度的变化对于植物体内的黄酮物质含量有着直接的影响，即便在不通过植物当中也有较高的氨基酸序列相似性，但与其他蛋白质有所差异。

（3）黄烷酮3-羟化酶基因（F3H）。作为类黄酮代谢调控的重要基因，F3H是一种关键结构酶，该基因呈现出一定的底物特异性，是作用于合成过程中的重要分支，在其催化作用下可以产生二氢黄酮醇类物质，但其作为一种加氧酶故在反应时需要Fe2+、O2等辅助因子的参与。不同植物当中的F3H表达模式以及基因拷贝数皆不同。

（4）二氢黄酮醇-4-还原酶基因（DFR）。作为花色素合成后期的关键酶，DFR的作用在于催化二氢黄酮醇促使其形成无色花色素，属于还原酶家族具备单基因编码特性，可以在NADPH的辅助下还原羰基为羟基，DFR的调控作用异常复杂具有一定的保守性，不同植物的不同生长时期和不同组织部位DFR的基因表达特性不同。

（5）花色素苷合酶基因（ANS）。作为花青素合成过程中的有色化合物，ANS属于双加氧酶家族，能够将无色原花青素催化氧化转换为有色，其作用于花青素合成的最后阶段，是一种小基因结构，具有明显的组织特异性。

1.2.2 花青素合成代谢相关调控基因

（1）MYB转录因子。作为一种DNA融合蛋白质，MYB结构域是一个高度保守的DNA序列，既具有特定的结合活性，也具有特定的序列特异性，在MYB结构域含有大约52种氨基酸，具有保守特征的氨基酸残基可以使MYB蛋白质折叠为不同的螺旋-螺旋-转角-螺旋结构，MYB转录因子既可以完成植物花青素合成正向调节，也可以对植物内的MYB蛋白质进行负调节。

（2）碱性螺旋-环-螺旋转录因子（bHLH）。作为植物中的第二大转录因子家族，bHLH最大的功能在于类黄酮以及花青素的合成调节，该类转录因子的蛋白结构较为保守，每个bHLH基序都含有超过60种的氨基酸残基，包含DNA结合区以及HLH两个保守结构域，分别由大量碱性氨基酸以及疏水氨基酸组成[4]。

（3）WD40转录因子。作为一类大蛋白家族，WD40机构具有高度保守的特点，含有4～16个不等基元序列，同时每个基元序列大约有41种氨基酸组成。整个花青素的合成过程中，WD40蛋白位于同一个进化分支，能够同bHLH转录因子或MYB类转录因子在共同的激活或者抑制作用下调控结构基本的表达，完成对花青素合成的调控。

2 桑椹高通量链特异性转录组测序文库的构建及测序

2.1 不同发育时期桑椹转录组测序文库的构建

分别对青果期桑椹（MG）、红果期桑椹（MR）以及紫熟期桑椹（MP）构建转录组测序文库，并利用Illumina Solexa测序技术完成链特异性测序分析，利用Trinity软件将所得到的数据完成拼接组装，利用BLAST软件分别完成GO、KOG等数据库的基因序列对比，参照分析结果与转录本注释结果完成差异表达的lncRNAs以及mRNAs的鉴定。

2.2 不同发育时期桑椹中lncRNA表达谱

分别对不同时期的lncRNA进行数据统计，同时完成上下频数据统计，结果表明lncRNA比mRNA水平离散度更低，同时在生物学的基础上分析lncRNA靶基因功能，利用荧光定量PCR分析发现桑椹花青素合成途径中相关基因表达与花青素含量正相关。

3 桑树Mul-UC3GT基因在花青素合成过程中的作用及其表达调控分析

3.1 克隆Mul-UC3GT基因测定同源度

以转录组提供的核苷酸序列为基础，以桑椹cDNA为模板，以PCR技术为手段得到Mul-UC3GT克隆基因，并利用NCBI软件对比同源蛋白质中植物氨基酸序列，发现Mul-UC3GT蛋白质川桑的UGT蛋白质所含有的氨基酸同源度高达98%，但与拟南芥序列所含有的氨基酸同源度仅仅只有29%，同时通过MEGA 5.0软件构建同源蛋白质的系统进化树，结果表明川桑矢车菊素-3-O-葡萄糖苷-2-O-葡糖基转移酶与Mul-UC3GT具备较近的亲缘关系。

3.2 获得转Mul-UC3GT基因拟南芥

以Mul-UC3GT基因核苷酸序列为基础，设计特异性引物并完成PCR扩增完成其与克隆载体的连接转化为感受态完成阳性克隆质粒提取，以BamHI以及Sall为根本进行阳性质粒的双酶切验证，构建Mul-UC3GT基因植物表达载体，并将其转化为GV3101感受态细胞，完成对拟南芥野生型植株的浸染。对阳性植株进行培养筛选，并进行DNA模板提取和PCR扩增，获取转Mul-UC3GT基因拟南芥，接下来完成RNA提取，反转录为cDNA，利用荧光定量PCR分析验证转Mul-UC3GT基因在转Mul-UC3GT基因中的丰度。通过对转基因植株与野生植株的对比发现，转基因植株花青素含量更高[5]，表明Mul-UC3GT基因的桑椹花青素的合成过程中具备正调控作用。为验证该结论，特对野生植株与转基因植株中的二氢黄酮醇-4-还原酶DFR以及无色花青素双加氧酶LDOX表达量进行分析，结果表明转基因植株中二者的表达量更高，同时也发现花青素修饰过程中的糖基化作用过程中的转移酶明显降低，证明了Mul-UC3GT基因的正调控作用。

4 Mul-CHS基因在花青素合成过程中的作用及其表达调控分析

4.1 克隆Mul-CHS基因完成同源化分析

整个过程同克隆Mul-UC3GT基因测定同源度一致，分析后发现Mul-CHS蛋白质与川桑的CHS蛋白质所含有的氨基酸同源度高达98%，与金丝桃、榴莲等植物中的查尔酮合成酶CHS的同源性也高达90%以上，说明CHS具有较强的氨基酸序列保守性。通过MEGA 5.0软件构建同源蛋白质的系统进化树，表明Mul-CHS与川桑CHS具备较近的亲缘关系。

4.2 获得转Mul-CHS基因拟南芥

同获得转Mul-UC3GT基因拟南芥过程，一致获取转Mul-CHS基因拟南芥。通过对转基因植株与野生植株的对比发现，转基因植株叶柄紫红色较为明显，而野生植株依旧为绿色，经过一系列的测定表明转基因植株花青素含量更高，表明Mul-CHS基因的桑椹花青素的合成过程中具备正调控作用。为验证该结论，特对查尔酮合成酶CHS在花青素合成上游催化过程中的基因表达量进行分析，同时完成了对肉桂酸-4-羟化酶C4H以及肉桂酰辅酶A连接酶4CL基因表达量的判断，结果表明转基因植株中肉桂酸-4-羟化酶C4H以及肉桂酰辅酶A连接酶4CL表达量明显降低，证明了Mul-CHS基因在花青素合成过程中的上游具备负调控作用、Mul-CHS基因在花青素合成过程中的下游具备正调控作用。

5 结语

经过对植物花青素合成途径的相关基因进行研究分析发现，植物花青素合成的途中受到结构基因和调控基因的影响，不同基因有着不同的功能。通过对桑椹中Mul-UC3GT、Mul-CHS基因的克隆以及转基因的建立分析发现，二者对花青素的合成有着一定的调控作用。不过值得注意的是，无论是何种植物其花青素的合成皆是在诸多基因相互合作、相互关联之下完成的，转录因子以及生长环境的影响也不容忽视，想要实现桑椹着色以及培育质量的提升还需从基因工程入手。