元素分析-同位素质谱法测定黄芪中碳、氮同位素比值及其在产地溯源中的应用

明荔莉 范稚莉 王海燕 毕彬彬 唐梓意 李婉莹

（拱北海关技术中心,广东 珠海519000）

黄芪作为一味珍贵的中药材,其药用范围广泛,具有补中益气、健脾益肺、托毒生肌之功效[1]。近年来,黄芪在医药、保健、养生领域的药用价值受到人们的重视,具有广阔的开发前景。我国黄芪的产地主要集中在山西大同、内蒙包头、东北野生芪、甘肃陇西、山东莱阳、乳山等地[2]。不同产地的黄芪,其水土、气候、日照、生物分布等生态因子差异很大,因而黄芪的生长特性具有一定的地域特征,其物理化学特点、产量和销售价格有所不同,其药效和品质也具有明显的地域差异[3]。长期的临床医疗实践表明,要保证中药材的品质,须强调地道药材开发和应用,这对于保证中药疗效,起着十分重要的作用[4]。

常用的中药材产地溯源技术有分子生物学[5,6]、指纹图谱[7]、同位素示踪[8]、无线射频识别技术[9]和条形码技术[10]。已有的研究表明,利用稳定同位素指标进行产地溯源相比其他方法,具有分析速度快、精度高、准确性好的优势[11]。同位素溯源技术的基本原理与依据是稳定同位素的自然分馏效应,由于不同产区的大气、土壤、水等环境中含有生源要素同位素组成具有差异,加之生物体内的同位素组成受气候、环境和生物代谢类型等因素的影响,不同地域来源的中药材中同位素自然丰度存在差异[12]。因此,利用这种差异可以区分黄芪其可能的来源地区。

本项目利用稳定同位素技术,建立元素分析-稳定同位素质谱法（EA-IRMS）,测定不同产地黄芪样品中碳、氮稳定同位素比值（δ13C,δ15N）,通过统计分析,探讨此方法在黄芪产地溯源中的应用。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

DELTA V ADVANTAGE 同位素质谱仪（美国Thermo Fisher 公司）,配备Flash 2000 HT 元素分析仪,ConFlo IV 万用接口。氦气（纯度99．999%,载气）、氧气（纯度99．999%,助燃气）、二氧化碳（纯度99．99%,参考气）、氮气（纯度99．99%,参考气）。8 mm×5 mm 锡杯；Milli-Q 超纯水制备系统。尿素同位素标准物质IVA 33802174,咖啡因同位素标准物质IAEA-600。

1．2 样品制备

来自4 个不同产地—山西大同、陕西子洲、甘肃陇西和内蒙,共24 个黄芪样品。样品经高速粉碎机磨碎、过筛后,保存备用。

1．3 仪器条件

1．3．1 元素分析仪条件

燃烧管温度（C、N 模式）:氧化还原炉温度为980 ℃,GC 柱温50 ℃,进样器氦气载气流速为110 mL/min,氧气流速为175 mL/min,吹扫气流速为200 mL/min。

1．3．2 ConFlo IV 条件

氦气压力为0．6 bar,CO2参考气压力为1．0 bar,N2参考气压力为1．0 bar。

1．3．3 质谱条件

离子源电压,2．9 KV；轰击电压,120．8eV；真空度,1．6 ×10-6mbar（针阀打开状态下）。

1．4 碳、氮同位素测定

称取约200 μg 粉末样品,用锡杯包好后,经氧化还原炉高温氧化还原和GC 柱分离,样品中的碳、氮元素转化为纯净的CO2和N2气体,再经过ConFlo IV万用接口对样品进行适当的稀释,进入质谱仪检测。由于黄芪中碳、氮含量差异较大,通过调节样品稀释比,分别对碳、氮同位素比值进行测定。

1．5 精度和准确性测定

测定前,用已知δ13C 和δ15N 值的尿素和咖啡因标准物质对CO2和N2参考气进行标定。样品的测定精度用尿素同位素标准物质来控制,每测定6个样品测定一个质控样品,质控样品的重复分析标准偏差小于0．3‰。每个黄芪样品重复测定3 次,计算标准偏差,考察方法测定实际样品的稳定性和再现性。

1．6 数据处理

采用Thermo electronisodat version 3．0 软件计算同位素值和获取数据。采用SPSS19．0（美国,IBM）进行统计分析,采用Origin 9．0 绘图软件（美国Originlab 公司）进行数据图绘制。

2 结果与讨论

2．1 稳定性

样品分析前,运行CO2、N2标准参考气体进行onoff 测试,直至连续10 组参考气体脉冲的δ13C、δ15N值的标准偏差（SD）分别小于0．06‰和0．3‰,才能进行样品测试。为了测试本方法对实际样品分析的稳定性,对每个黄芪样品分别进行3 次重复性分析,结果表明（见表1）,样品δ13C、δ15N 值的SD 值均小于0．3‰,均在仪器分析允许误差（0．3‰）范围内,满足稳定性要求。

表1 不同产地黄芪样品中δ13C、δ15N 值Tab．1 δ13C and δ15N values in Astragali Radix_among different regions

2．2 精度和准确度

样品的测定精度和准确度,用实验室质控样品来控制。重复10 次测定已知δ13C、δ15N 值的质控标准物质,10 个质控样品δ13C、δ15N 值的SD 分别为0．053‰、0．115‰,表明EA-IRMS 法的精度能到达要求。

2．3 碳、氮稳定同位素比值

不同产地黄芪中δ13C 和δ15N 值箱线图结果见图1。山西大同不同种植基地黄芪的δ13C 值接近,波动范围在-26．770‰～-25．007‰之间；陕西子洲黄芪的δ13C 值波动范围小,在-26．391‰～-26．039‰之间；内蒙黄芪的δ13C 值范围为-26．245‰～-25．092‰；甘肃陇西黄芪的δ13C 值范围为-24．422‰～-22．780‰,相对其它产区其δ13C 值明显偏负。

图1 不同产地黄芪的δ13C、δ15N 值的箱线图Fig．1 The boxplots of δ13C and δ15N values in Astragali Radix among different regions

山西大同不同种植基地黄芪的δ15N 值接近,波动范围在-0．667‰～0．145‰之间；陕西子洲黄芪的δ15N 值波动范围小,在-0．671‰～-0．263‰之间；甘肃陇西黄芪的δ15N 值范围为-2．440‰～-0．187‰；内蒙黄芪的δ15N 值范围为-2．107‰ ～1．156‰。δ15N值是土壤氮来源、土地利用方式、耕作措施等的指示,同一地区不同样品间变异较大[13]。甘肃陇西和内蒙产地的黄芪样品δ15N 值范围波动较大,说明该地区在种植黄芪的土壤氮来源、土地利用方式或耕作措施上可能存在较大的地区性差异。

2．4 产地溯源分析

黄芪碳、氮稳定同位素比值分析表明（见图2）,甘肃陇西黄芪与其它3 个产地的δ13C 值均存在显著性差异（p ＜0．002）,山西大同、陕西子洲和内蒙产地黄芪的δ13C 值无显著差异,但各产地黄芪的δ15N 值无显著性差异。研究表明,δ13C 值的差异是产区温度、有效水含量等环境因子的综合反映,部分地区间差异不显著[13]。甘肃陇西与其它产地黄芪中δ13C 值存在显著差异,体现了甘肃陇西黄芪生长环境与其它产区存在明显差异。甘肃陇西地区四季分明,日照充足,气候温和,年平均气温6．2 ℃,平均降水量445 mm,黄芪生长气候高寒阴湿,土地肥沃疏松,具有黄芪生长独特优越的地理条件。利用稳定碳同位素比值,甘肃陇西黄芪能够有效地区分与其它产地,说明稳定碳同位素可应用于黄芪的产地溯源。

图2 不同产地黄芪的δ13C 和δ15N 值Fig．2 δ13C and δ15N values in Astragali Radix among different regions

3 结论

EA-IRMS 法能够快速测定黄芪中碳、氮稳定同位素比值,测试结果准确可靠,准确度和精度均满足要求。对山西大同、陕西子洲、甘肃陇西和内蒙4 个不同产地的黄芪样品的分析表明,利用稳定碳同位素比值能将甘肃陇西黄芪与其它产地有效区分,说明稳定碳同位素技术可应用于黄芪的产地溯源。