伪狂犬病毒分子生物学检测方法研究进展
2021-11-27万娟
万娟
(贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025)
伪狂犬病(porcine pseudorabies, PR)又称奥耶斯基病,是由伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的可以导致猪、牛、羊等多种动物死亡的一种急性、热性、高度接触性传染病。其临床症状为体温升高、全身瘙痒、多器官功能衰竭、瘫痪等。虽然PRV 可以感染多种动物,但是猪是其唯一的自然贮存宿主。几乎所有阶段的猪都可感染该病毒,该病严重危害我国养猪业的发展,国际动物卫生组织已将其列为法定报告传染病。
2011 年起我国各地开始陆续在传统疫苗免疫的猪场暴发PRV,说明PRV 开始出现了变异,而传统疫苗对于变异株不能起到良好的免疫保护作用。在2018 年报道了一例关于PRV 感染人的事件说明了该病毒已经具有感染人类的能力,能够及时诊断出PRV 是控制PR 的前提。病毒分离鉴定是实验室诊断中最经典可靠的诊断方法,但该方法过于繁琐并且诊断所需时间过长不能满足生产实际需求。在分子生物学方法方面,人们建立了q-PCR,减少了检测所需时间,为了基层检测需要,建立了不需要特殊仪器设备的环介导等温核酸扩增技术,近几年,随着纳米PCR 方法的出现,人们又建立PRV 纳米PCR 检测方法显著提高了反应灵敏度,PCR-LFD 技术将PCR 与横向流动试纸条、核酸探针相结合,不仅增加了其特异性还消除了电泳对环境造成的污染。本文从PRV 的分子生物学检测方法进行综述,以期为临床快速诊断PRV 所用方法的选择提供一定的依据。
1 分子生物学检测方法
1.1 荧光定量PCR
荧光定量PCR 在常规PCR 基础上引入了荧光探针,从而提高特异性和敏感性,并且不需要进行凝胶电泳从而降低了开盖点样时的污染,可直接通过电脑观察到实时结果大大降低检测所需时间,在2 个小时左右就可以完成。徐黎辉等通过制备并纯化PRV g E 蛋白单克隆抗体,成功建立了能够快速检测PRV 野毒的直接免疫荧光检测方法。李晓菲等根据PRV g E 基因设计引物和探针建立了能够区分野毒和疫苗毒的TaqMan 荧光定量检测方法。李艳等根据PRV g E 基因保守区域设计特异性引物和LNA-TaqMan 探针,建立了基于LNA-TaqMan探针的猪伪狂犬病毒野毒荧光定量PCR 检测方法。TaqMan 荧光定量方法与常规PCR 相比其特异性高10~100 倍,不存在交叉污染且能够对核酸进行定量检测,不需要进行电泳这一步,缩短了检测所需时间,但该方法加入了探针因此提高了检测成本,并且需要特殊的设备才能观察到反应结果,故并不适合基层诊断PRV 使用。
1.2 环介导等温核酸扩增技术
环介导等温核酸扩增(LAMP)是一种在恒定温度下利用Bst DNA 聚合酶和内外两对引物对靶序列上的六个独立区域进行特异性识别,而后启动循环链置换反应产生哑铃状DNA,再以该DNA 为模板进行延伸形成茎-环DNA 结构的新型核酸扩增技术。该技术操作简单且特异性强、反应所需时间短、对设备要求不高,目前在多种病原体的快速检测中已经开始广泛使用。陈珍金等根据PRV gB 基因序列的保守区域设计了4 对特异性引物并筛选出特异性强的引物PRV-1,缩短了反应时间,建立了能够通用检测PRV 的环介导等温核酸扩增技术。许宗丽等根据PRV gB 基因的保守序列设计了一套特异性引物建立了PRV LAMP 可视化检测方法。
1.3 纳米PCR 方法
PRV G+C 含量高达74%,引物的Tm 值很高,因此采用常规PCR 法可能会对敏感性产生影响。纳米PCR 作为一种新型PCR,在普通PCR 的基础上加入了1~100 纳米的纳米粒子,在反应液中当反应体系温度发生变化时形成纳米流体从而提高升降温的速度,提高了引物和模板配对的效率,由此减少了退火温度对体系的影响。张悦勇等参照PRV gB 基因的保守序列设计特异性引物建立纳米PCR 方法扩增出了338bp 的特异性目的片段。纳米PCR 相比于普通PCR 来说,由于有纳米粒子的参与,因此其灵敏度显著升高,特异性也提高许多,并且目前已有纳米PCR 试剂盒的售卖。
1.4 PCR-LFD 技术
PCR-LFD 技术是将PCR 技术、核酸探针杂交技术与横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)三项技术相结合,应用试纸条直接检测PCR 扩增产物的技术,该方法不需要电泳从而减少了检测所需时间,提高了工作效率,目前在口蹄疫病毒、结核分支杆菌等方面有报道。张莉等根据PRV g E 基因设计两对特异性引物和其相应的探针,并将下游引物标记荧光素、探针标记生物素,建立了特异性检测PRV 的PCR-LFD检测方法。廖文军等用纯化的抗人红细胞单链抗体-PRV g E 蛋白双功能融合蛋白为检测线和胶体金标记物,以羊抗猪Ig G 作为质控线,采用双抗原夹心法制备了检测PRV gE 抗体的双抗原胶体金试纸条。随后,王华俊等将单克隆抗体技术和荧光微球免疫层析技术相结合,制备PRV g E 抗原检测试纸卡。该方法利用试纸条代替电泳避免了溴化乙锭等核酸染料对环境的污染,用试纸条检测是否出现两个条带以此来判断PCR 产物的阴阳性,假阳性时也不会有两条条带的产生,并且目前已有伪狂犬病毒PCR-LFD 检测试剂盒的售卖。该试剂盒可用于进出口检疫、实验室、饲养场等的临床样品检测。
2 小结
目前,我国大多数猪伪狂犬疫苗为基因缺失疫苗,而目前伪狂犬变异毒株大多数也为基因缺失株,使得野毒株的诊断变得更加困难。随着分子生物学的发展,目前科学家们建立了许多PRV 分子生物学,如qPCR,虽然精确度更高且操作简单,但需要特定的设备和仪器,不适合临床上使用;LAMP 是近几年兴起的一种方法,该方法由于对设备没有很高的要求,因此可以广泛应用于基层且结果可以直接观察到,节省了检测所需时间,但该方法容易有假阳性的出现;纳米PCR 方法是一种新型技术,该方法由于有纳米粒子的加入,特异性比普通PCR 提高了100 倍左右;横向流动试纸条不需要电泳减少了污染,且特异性和灵敏度与PCR 法相比,由于自身设备条件的不同因此选择的方法也不同。相信随着科学家们研究的不断深入,将会有更好的检测PRV 的方法,从而为PR 的诊断和防控提供更加良好的条件和保障。