利用CRISPR-Cas9技术敲除番茄中DMR6直系同源物使其获得广谱抗病性

2021年7月，加州大学创新基因组学研究所Brian Staskawicz 课题组通过CRISPR-Cas9技术敲除番茄中感病基因DMR6直系同源基因SIDMR6-1，使其获得广谱抗病性。相关研究结果发表在期刊《Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America》上。

DMR6编码了一个2-氧代戊二酸Fe（II）依赖性加氧酶（2OGO），在病原菌感染期间上调表达。DMR6及其同源类似物DMR6-Like Oxygenase1（DLO1）是植物免疫的抑制因子，在病原体感染期间会共表达。番茄中有2个AtDMR6直系同源基因：SlDMR6-1（Solyc03g080190.3）和SlDMR6-2（Solyc06g073080.4）；其中只有SlDMR6-1响应病原菌侵染，设计2个sgRNA分别靶向SlDMR6-1的外显子2和外显子3。利用农杆菌介导转化方法的获得了61株T0材料，其中有5株（8.2%）纯和突变体。对这些突变体的抗病能力进行检测发现，SlDMR6-1突变体对3种进化上不同的病原体的抗性均有显著增强；同时，在突变体中观察到抗性增强与SA水平升高相关，表明抗病性可能与SA介导的免疫反应的激活有关。为了分析响应病原体感染的SlDMR6-1在植物免疫中起的作用，对3种不同基因型的番茄叶片进行转录组分析，结果表明与野生型相比，突变体中有大量的基因发生了差异表达。对这些差异基因进行GO富集发现，上调的DEG在与植物免疫相关的生物过程中富集，例如，SA反应和先天免疫反应，表明即使在没有病原体的侵染下植物防御也被激活；同时还有大量与发育相关的代谢途径受到抑制，但这些植物并没有表现出任何生长发育受阻现象。为了研究SlDMR6-1和SlDMR6-2的酶学特性，将这2个基因克隆到pET28a载体中。将纯化后的蛋白质用于酶活测定，产物通过HPLC进行分析。在测试条件下，SA在AtDMR6存在下转化为2,5-DHBA，而当用柚皮素作为底物时，不会形成其他化合物。综上所述，S基因DMR6可促进卵菌和细菌病原体感染植物体，在各种经济作物如番茄、可可和木薯等中保守存在。在番茄中仅SlDMR6-1可能在免疫反应中发挥作用。SlDMR6-1突变体具有广谱抗病表型，在突变体中抗性的获得与SA介导的激活相关。