苏云金芽孢杆菌毒素杀灭谱：从昆虫到人类癌细胞

2021-11-27张琳琳杜忠华

绿色科技 2021年6期

张琳琳,杜忠华

(夏津一中，山东德州 254300)

1 引言

苏云金杆菌是一种革兰氏阳性且产孢的细菌，广泛分布于世界各地的土壤、植物和昆虫中[1]。Bt之所以广为人知，是因为它能产生多种用于农业害虫防治的毒性蛋白(Cry、Vip、Sip)[2]，抑制蚊虫传播疾病(Cyt)[2]，并且对人类癌细胞具有毒性(PS、SLP和Cry)[3]。Bt的主要特征之一是在芽孢形成过程中，在芽孢旁边产生具有立方形、双锥状、球形、椭圆形或不规则形状伴胞晶体，它们是由δ-内毒素单体聚集而成，根据它们的序列相似性可分为Cry和Cyt毒素。此外，Bt在其生命周期种还可以产生其他重要的毒素，如副孢毒素、表层蛋白、Vip和Sip蛋白。目前，Bt毒素已被分离并分类为至少78个Cry、3个Cyt、6个副孢毒素蛋白、1个SLP、1个Sip和4个Vip蛋白家族。这些都将在本文进行阐述。

2 Bt内毒素

2.1 Cry毒素

Cry蛋白因其对膜翅目、鞘翅目、同翅目、直翅目等昆虫以及线虫、螨类和原生动物等具有毒性而广为人知[2]。它主要以传统的杀虫制剂或转基因作物形式应用于害虫的生物防治。

Cry毒素主要是在Bt芽孢形成过程中产生，根据其序列同源性提出了一个四级分类系统。序列同源性小于45%的Cry毒素在初级水平上不同，如Cry1、Cry2等。序列同源性大于78%的Cry毒素被进一步分为二级，名称加上大写字母，如Cry1A、Cry1B。95%同源性的毒素构成第三级的边界并用小写字母区分这些蛋白质，如Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac。

Cry蛋白的晶体结构显示其含有3个结构域，因此，Cry毒素也被称为3d-Cry毒素。结构域I主要与毒素的寡聚化和在细胞膜上形成穿孔有关。结构域Ⅱ与毒素的特异性有关，参与和受体的结合。结构域Ⅲ与受体特异性结合和细胞膜上的孔隙形成有关[2]。3d-Cry蛋白可由分子量约130 kDa的长原毒素产生，如Cry1Aa蛋白；或分子量为65～70 kDa短原蛋白产生，如Cry11Aa蛋白[4]。长原毒素在C端和N端由昆虫中肠蛋白酶处理加工，而短的原毒素只在N端进行加工，产生分子量约为60～70 kDa的核心活性区域，保留了3d结构，该片段对昆虫幼虫、线虫、原生动物和人类癌细胞具有细胞毒性[4]。

穿孔机制模型是被普遍接受的Cry毒素的作用机制模型[5]，另外还有信号通路模型等杀虫机制的提出[5]。

2.2 Cyt家族

Cyt毒素的大小从25～28 kDa不等；它们的三维结构显示Cyt蛋白是一个单一的α-β结构域，与Cry毒素序列同源性较低[6]。Cyt毒素主要对作为人类疾病媒介的蚊子有活性；如按蚊属(疟疾)、伊蚊属(登革、寨卡和基孔肯雅)和库蚊属(尼罗河热和裂谷热)[6]。Bt以色列亚种(Bti)由于可以产生Cry4Aa、Cry4Ba、Cry10Aa、Cry11Aa、Cyt1Aa、Cyt2Ba和Cyt1Ca毒素，被常用来控制这些媒介生物[6]。到目前为止，主要鉴定了3个Cyt毒素亚家族，它们都具有很高的序列同源性：Cyt1(1Aa，1Ab，1Ab，1Ac和1Ad)，Cyt2(2Aa，2Ba，2Bb，2Bc，2Ca)和Cyt3Aa1。

Cyt毒素还与不同家族成员之间具有协同作用。当Cyt1Ab和Cyt2Ba共同作用时，它们增强了对埃及伊蚊幼虫和致倦库蚊幼虫的杀虫活性。Cyt1Aa的两个已知表位(196EIKVSAVKE204和220NIQSLKFAQ 228)与Cry4B和Cry11Aa毒素结合，增强其对白按蚊和致倦库蚊的毒性作用[7]。当Cyt1Aa与膜细胞受体结合时，Cry11Aa或Cry4B与这种毒素结合，增加寡聚和孔形成效应[7]。

2.3 副孢蛋白

副孢蛋白与Cry毒素的氨基酸序列同源性低于25%。然而，它们的作用机制非常相似，这两个家族都能识别癌细胞上的特定膜受体，从而触发细胞死亡[8]。副孢蛋白不诱导溶血活性，但可能具有杀虫活性，它们在体外对人类癌细胞而不是健康人体细胞表现出优先的细胞毒性。

广泛地筛选分析发现了Bt菌株可能的新靶点，表明非杀虫Cry蛋白比杀虫Cry蛋白在自然界中分布更广泛。这也促使研究人员对非杀虫和非溶血性Cry蛋白可能的生物活性或靶点进行了研究。Mizuki等在1999年对1744株Bt菌株的蛋白酶消化的伴胞蛋白进行大规模筛选分析后，首次报道了Bt的δ内毒素对白血病细胞具有选择性细胞毒性。这也引发了后续对癌细胞具有细胞毒性的非杀虫和非溶血性毒素的广泛筛选，从而导致了一种新型的Cry蛋白的分类，称为副孢蛋白(PS)[9]。首先，这个新分类包括所有非杀虫和非溶血性Cry毒素，它们对癌细胞具有选择性细胞毒性[9]。一段时间后，人们认为非溶血性但有杀虫活性的蛋白也可能是这一分类的一部分[9]。到目前为止，共鉴定出19种副孢蛋白，并分为6个家族[9]，并且副孢毒素对癌细胞的作用机制尚不清楚。

2.4 SLP蛋白

表面层蛋白(SLP)在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中都有广泛的存在，包括芽孢杆菌。表面层蛋白(SLP)可嵌入许多革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的细胞膜中；它们通常与多糖和肽聚糖结合。SLP蛋白的主要功能是：与细胞外蛋白相互作用；抵御病原体；吞噬作用；膜稳定；粘附等[10]。与cry基因不同，cry基因是在孢子形成过程中表达的，SLP在整个细胞生命周期中都有组成性表达。SLP毒素活性尚不清楚，有人认为SLP与Cry蛋白具有相似的杀虫活性，但机制不同[11]。最近的一项研究报道了Bt的SLP对MDA-MB-231乳腺癌细胞株具有高选择性细胞毒活性，作者认为癌细胞中存在的钙粘蛋白-11受体似乎参与了与SLP的识别，但其作用机制仍在研究中[3]。

3 Bt分泌的毒素

除了孢子形成期间产生的Cry、Cyt、PS和SLP毒素外，Bt还可以在营养生长期分泌其他具有杀虫活性的毒素。主要有两个家族，一个是营养型杀虫蛋白(Vip)[12]，另一个是分泌型杀虫蛋白(Sip)[13]。

3.1 Vip毒素

Vip毒素是Bt在其营养生长期产生并直接分泌到胞外的一类毒素，它的表达一般在Bt孢子形成期开始之前结束[12]。这类杀虫毒素根据其序列同源性主要可分为四类：Vip1、Vip2、Vip3和Vip4。目前已报道的Vip蛋白有15种Vip1蛋白、20种Vip2蛋白、101种Vip3蛋白和1种Vip4，它们对昆虫的作用机制尚不完全清楚。

Vip1原毒素约为100 kDa，分泌后会形成约80 kDa的成熟毒素，此外，Vip2会形成约50 kDa的成熟片段[12]。Vip1和Vip2是以二元毒素的形式发挥毒性，对一些鞘翅目和半翅目的害虫具有协同杀虫活性[12]。Vip2在结构和功能上与艰难梭菌的CdtA毒素相似；该毒素具有ADP核糖基转移酶活性，其主要靶点是肌动蛋白，因此，当其被激活时，可能会导致细胞骨架破裂和细胞死亡[12]。在单体形式下，Vip1与其受体结合，从而促进Vip1毒素的多聚化，多聚化的Vip1进一步将Vip2转运到细胞质中。一旦进入细胞，Vip2破坏肌动蛋白丝，破坏细胞骨架，最终导致细胞死亡[12]。

Vip3对多种鳞翅目昆虫具有明显的毒性。Vip3原毒素约为88kDa，与其他已知的杀虫蛋白没有同源性[12]。与Vip1和Vip2相比，Vip3中的信号肽序列在分泌过程中不被加工，而是存在于成熟的分泌肽中，这表明它们在蛋白质结构和杀虫活性中起着重要作用。经蛋白酶处理之后, Vip3会被酶解成约66kDa和19KDa的激活状态，两个片段仍然结合在一起。Vip3以四聚体的方式存在，其作用机制尚不清楚。

Vip 4是最近发现的Vip家族成员，分子量约为108kDa，其研究较少[12]。

3.2 SIP毒素

分泌型杀虫蛋白(Sip)是Bt所分泌产生的分子量约为41kDa毒素蛋白[13]。与Vip蛋白类似，Sip毒素N端包含一个由30个氨基酸组成的信号肽序列，通过蛋白酶处理后，会释放出具有杀虫活性蛋白片段[13]。研究显示Sip蛋白对鞘翅目昆虫具有杀虫活性，如马铃薯甲虫和玉米根虫等[14]。但作用机制并不清楚。