水质在线生物监测技术研究进展

何 蕾，韩施悦，黄啟慧，夏威林，谢健强，陈立斌

(长江大学 资源与环境学院，湖北 武汉 430100)

1 引言

水是人类生存和发展必不可缺的重要资源之一。工业的高速发展及人类生活生产活动给水环境带来了各种污染问题[1]。目前我国大陆地区的水体普遍受到了持续性的污染且污染状况日趋严重，尤其是近年来频发的突发性水体污染事故，严重威胁到了当地居民的用水安全，不仅对人群的身心健康产生威胁还对当地的生态环境造成了严重的破坏[2]。此外，突发性水体污染也会给水产养殖行业带来巨大的经济损失，严重影响了社会安定和秩序[3]；例如广西壮族自治区龙江河曾经的镉污染突发事件[4]，峰值时镉浓度值超标约62倍；四川省彭州市的柴油泄漏事件造成下游地区供水中断，在当地造成严重的不良影响；吉林松花江苯类物质(苯、硝基苯等)污染事件，造成了江水严重污染，沿岸数百万居民的生活受到巨大的影响。

大量的污染物在较短的时间内进入水体并对水环境造成严重危害的污染事件，是水体突发性污染事件，污染物在水体中扩散很快，因此水体突发性污染事件通常发生非常迅速且难以辨别具体的污染物质[5]。由于污染物排放没有固定的时间、方式和途径，污染物在水中扩散极快且会随着水体流动而扩大影响范围，所以在水体突发性污染事件中是难以确定排放的污染物类型的，这就加大了我们对污染事故的应急处理难度[6]。因此，充分了解水质在线生物监测预警系统的发展现状，建立更完善的监测预警系统，利用更科学、有效的监测手段来实时在线监测水质已成为水体污染监测和评价的重要措施[7]，从而达到对水体突发污染事件的及时预警的目的。

常用的监测手段有物理监测、化学监测和生物监测。其中物理监测和化学监测通常是对水体理化性质的监测，如温度、色度、浊度、pH、悬浮物、溶解氧、化学需氧量、生化需氧量、有毒重金属和有机农药等，这种传统的监测方式多由人工携带便携式监测仪器现场监测或是由固定站点连续监测，成本高，所得到的结果远远滞后于水体的变化情况，且往往是反映某单一指标的变化状况，不能全面地反映水质各方面指标的变化状况[6，8]。目前的生物在线监测技术的建立主要依赖于水生生物对有害污染物的不同毒理学反应参数，监测水生生物的生理或行为的改变，通过收集、整合、分析和传输数据对水体可能发生的污染提供快速并且准确的警报，从而可以在突发性水体污染事件发生的时候，及时发出预警[9]，同时它的预警范围相较于传统的监测方式更广，不仅可以用来判定和评价单一污染化学物质，还可以用来直接判定多种混合化学物质或复杂的工业废水的综合毒性[6，10，11]。在实际应用中，水体的毒性效应是一项包含多种指标的生物学参数，是所组成物质拮抗作用或抑制作用的综合结果[12]。当前用于水体毒性测试的生物学方法主要有发光细菌法、藻类法、鱼类法、贝类法、蚤类法、电化学活性微生物法以及多种生物联合法等[13]，这些方法因其生物特性、生存环境以及个体或群体行为等条件的不同，其操作的复杂程度及实用性等效果也有所不同[14]。

本文综述了国内外采用不同生物作为受试生物的生物在线水质监测预警的研究发展进程及其优缺点，为生物水质监测预警技术的研究和发展提供参考。

2 以鱼类为受试生物进行水质监测预警的研究进展

鱼类是较早被作为生物在线水质预警的生物指示种。1929年国外开始出现利用鱼类死亡率或其呼吸变化为监测指标的鱼类在线监测系统，与此同时，以鱼类的正趋运动、回避行为、耗氧率等为指标的生物监测仪器也开始大量出现[15，16]。早期的鱼类水质监测主要针对生物器官、个体、群落、系统的变化进行统计观察，其实验对象是较大型的蓝鳃太阳鱼、虹鳟等，所需的试验场地、试验药剂以及对污染物的敏感性都具有一定的局限性。其中，蓝鳃太阳鱼作为温水性中小型鱼类，生长适温范围广，对水体中的重金属、有机溶剂及杀虫剂能比虹鳟做出更迅速、更精准的生理反应，除此之外，蓝鳃太阳鱼对其它类型的污染物的反应程度的生理反应明显下降[17]。后期对孔雀鱼、剑尾鱼、斑马鱼等小型鱼类进行水质监测预警的方法随着水质在线监测预警技术的持续发展不断衍生[6，18]。20世纪70年代以后，斑马鱼开始受到众多环境毒理学家的高度重视。随着人们的研究发现，斑马鱼有体型小、繁殖快、生活场地小、成本低且具有与人类类似的基因组成等优势，这使其成为专家们进行有毒物质胁迫下的急性毒性试验研究以及污染物的积累效应研究的重点试验对象[19～23]。

随着鱼类监测技术的发展，国内外出现了大量的鱼类监测模型及系统。一种基于Light GBM模型的鱼类异常行为的检测技术随之诞生，其精度高、占用内存少、运算速度快、准确率高、支持并行化学习、可处理大规模数据，因而在鱼类监测方面逐渐得到广泛应用。有研究表明，有效的特征提取可以提高鱼类异常行为检测的精确度，但自然条件下水质环境较为复杂，易产生其它因素干扰。因此为进一步提高模型的鲁棒性，即在异常和危险情况下系统正常运行的能力，实际应用还需要考虑鱼类行为的其他特征(如运动加速度、游动轨迹)[24]。其次是利用计算机视觉技术监测鱼的活动电位变化、应激行为等指标[25～27]，以鱼类活动电位的功率频谱密度测量取代电压测量[28]。此方法将鱼类活动电位按照不同的运动方式的相应的频率分为呼吸电位频率和游泳电位频率，通过对呼吸电位频率和游泳电位频率的共同数值监测得来的水质数据能够涵盖更大范围的污染物浓度，即提高了单一监测系统对水中毒物的敏感度；除此以外，加上读取呼吸运动所占的功率和游泳运动所占的功率在总运动功率中的各占的比例能在进一步提高单一监测系统对水中毒物的敏感度的基础上消除由于鱼类的个体行为、生理差异等带来的监测误差，进一步提高了系统的精确度。尽管将鱼类活动电位按照不同的运动方式相应的频率来监测提高了相应的精确度，但目前以鱼类活动电位的功率频谱密度测量取代电压测量的方法只能对毒性较强的污染物例如氰化物、硫化物等进行水质监测，而为了将该方法应用于大多数情况即证明任何实际情况下实验判据选择的合理性以及整个系统的灵敏性，该方法还需要和目前国际先进的毒物监测系统(如德国的MFB等)进行所用毒物的浓度以及检测所需时间的对比[28]。除上述技术外，鱼类监测技术还有基于卡尔曼滤波的鱼群三维跟踪算法技术[29]、基于视觉化的计算机监测系统分析斑马鱼的应激行为并运用RGB颜色空间下的红蓝分量差分法实现运动目标监测技术[24]和以鱼死亡为终点的应急监测技术[30]等。

鱼类作为最古老的脊椎动物，又是水生态系统中的顶极群落，在环境因子的影响下，鱼类不仅能够反映各类污染物对水中生物不同程度的影响，也能直接反映污染物对鱼类所处的环境胁迫影响，由此，鱼类常被作为水体环境状况的指示生物[17]。监测项目中利用到了鱼类的回避反应等，用于监测的参数则包括鱼类的活动规律、呼吸行为和放电行为等，监测指标各异，数据处理较为繁琐复杂，且不及时处理死亡的受试生物会进一步加剧监测水体的污染，使附加成本大幅提高[31]。另外，使用鱼类进行水质在线监测的仪器及鱼苗供应商能够保证监测项目的正常开始，但随着实验的进程，鱼类在生长的过程中出现的各类问题需要一定的鱼类养护技术和经验才能保证项目的顺利进行，人力成本也随之增加。

3 以发光细菌为受试生物进行水质监测预警的研究进展

细菌毒性监测技术采用的菌种通常有发光异短杆菌、明亮发光杆菌、费氏弧菌、青海弧菌、羽田希瓦氏菌[32]等，而在对亚铁硫杆菌法、硝化细菌法和发光细菌法在内的多种细菌生物毒性监测方法中，发光细菌法有着更明显的优势且应用更为广泛，在卫生、环保、疾控领域都有大规模的应用[33，34]。发光细菌是一种非致病的革兰氏阴性厌氧细菌。发光细菌在正常的生理条件下能够发射波长在450～490 nm的蓝绿色可见荧光。当与外来有毒污染物质接触时，其新陈代谢会受到影响，根据污染物性质和毒性的不同发光强度会减弱甚至熄灭[35]。在1672年发现发光细菌的发光受化学物质抑制这一现象以后，有学者在1976年发现并阐明了有机物对发光细菌的发光抑制效应以及毒性作用机制，之后相继衍生出的生物毒性测试系统、便携式毒性测定仪等监测系统或监测仪器都促进了生物毒性监测的发展。其中基于费氏弧菌的常用监测仪器型号有荷兰TOXcontrol、美国US Almightier和深圳朗石Lumifox8000[36，37]等,而英国的AMTOX检测仪和日本的固定化菌膜传感器[38]则是基于硝化细菌对有毒物质的反应的监测仪器。用于环境毒物监测的发光细菌法起源于20世纪80年代，它通过光电检测系统测试发光细菌的发光强度，在特定范围内有毒物浓度的高低与发光细菌的发光强度的强弱呈剂量-效应关系[32，39，40]，因此可根据发光细菌的发光强度大小与有毒物浓度呈负相关关系这一规律来推算出毒物浓度[14，19，32，41，42]。1995年我国颁布应用发光细菌进行水质毒性测试的标准以后，大量学者开始研究重金属、有机溶剂、除草剂等不同种类的污染物对发光细菌的毒性评价，研究发光细菌的最佳测试条件以及其与污染物的相关性等。

发光细菌生物监测技术的设备操作简单、具有较好的可扩展性，在国内外的饮用水安全、食品饮料安全及水质污染监测预警等领域应用十分广泛。此外，发光细菌法有国际标准(ISO 11348-3-1998)和国内标准(GB/T15441-1995)支持，其评价指标及体系也具有较大的权威性[14，34，42，43]。但是由于发光细菌需要定期更换菌种，维护周期较短(一般为1～2周一次)，因此运营成本也较高[32，34]。发光细菌生物毒性监测技术具有可进行应急检测、检测时间短以及检测谱宽的特点。但是发光菌种的生物毒性有效期较短，不适合用于较长时间段的全自动监测。目前我国大多数水质检测都是实验室内指标的检测，而在自然环境中运用的更广的生物毒性的检测还处在发展阶段，需要进一步研究。此外，发光细菌的生物毒性监测仪器的成本较高且需考虑水体内营养物质对监测结果的影响也是其需要格外注意及改进的部分。

4 以藻类为受试生物进行水质监测预警的研究进展

藻类是一类通过细胞营养性分裂，或借助于单细胞的孢子、合子的方式进行生长繁殖的悬浮生活在水中的水生生物，其群落结构特征被广泛应用于评价和监测水质[44，45]。藻类常被用作化学品毒性测试，特别是重金属离子的毒性测试的指示物种。常用的藻类监测系统有德国bbe公司藻类在线水体生态毒性检测系统(A-Tox)和藻类在线荧光检测系统[46，47]等。其中Algae Toximeter[46]是一种对水体中藻类新陈代谢导致的叶绿素含量荧光光谱和荧光动力变化在线分析的系统，该系统对除草剂尤为敏感，它将标准化培养的藻类自动加入受测水体中，实时监测其叶绿素浓度的变化，当水质发生变化的时候，产生的环境胁迫会降低藻类的新陈代谢使其叶绿素水平降低，激发系统警报。该系统装置不需要进行特殊的管理，受试生物的更换周期为7d，并且可以进行自动清洗，进行24 h不间断的监测，通过电脑或手机远程监控，断电后再通电也可正常运行，但其不能反映污染物的浓度与种类，只能起预警的作用；而应用的最典型的技术则是光电子技术，藻类分析法以水藻作为探测生物，利用叶绿素荧光技术连续检测被测水样，一旦有毒物质进入水体，受到毒性作用的藻类的光合作用强度减弱、活性降低，平行对比正常生理条件下藻类光合作用的活性，根据两者的差异得知污染物毒性的强弱；以此技术为基础的藻类在线检测仪，可以快速测得叶绿素荧光值与叶绿素浓a浓度、细胞密度的相关性等，因为不同藻类对设定波长的激发光所响应的荧光光谱不同，根据测得的荧光光谱及其强度，对藻类进行分类和定量检测，获得水环境实时监测数据，为灾害性事故和水华的发生做出预判[47,48]。此外，用于检测水质的方法还有通过生物催化剂的发光和真核藻类氧气的产生量测定光合作用行为的强弱，或对比藻类细胞(如单细胞鞭毛眼虫藻)的活动或其游走孢子(如石莼)的释放规律[42，49,50]。

藻类对除草剂类的农药、重金属等较为敏感，并且有国际标准ISO8692支持，但是藻类对杀虫剂的敏感度较低，且不稳定、受基准藻培养质量影响较大[43]。此外，以藻类为探测生物的仪器，通常都会选择培养驯化当地物种，需要一定的驯化技术和培养经验，且藻类更换较为频繁[50]。

5 以贝类为受试生物进行水质监测预警的研究进展

早期美国有学者将淡水蚌作为受试生物对碳氢化合物、放射性元素、金属稳定同位素等污染物进行监测，之后科学家发明了通过电磁感应技术来感应壳瓣运动的监测系统[51]。英国、美国、法国和澳大利亚等国家则利用牡蛎和贻贝监测水质变化[52,56]。贝类在水体中通过过滤水体中的藻类等微型生物吸取营养来生长繁殖，它在不利环境下会产生紧闭外壳的现象来排除外界刺激物。在水体被污染的情况下，贝类的运动状况会因污染物的种类和浓度不同而受到不同程度的影响。因此，贝类动物生物毒性监测技术通常利用贝类动物的防卫机能即贝类遇到外界刺激时会发生闭壳反应来监测水质毒性[18，41，50，57]。目前常用的贝类监测生物有斑贻贝、普通贻贝、河蚌、珠蚌、食用牡蛎等[11，58～61]。

贝类对重金属、农药较敏感，但是相应的标准生物物种较少，可供选择的探测生物种类范围较小[43]。相比于其他探测生物而言，采用贝类作为受试生物时通常选用当地物种，所以使用和购买都较为便利。此外，贝类生存能力较强，其更换周期相比于其他传统受试生物会较长一些[50]，考虑到其个体较大、所需检测时间较长且个体差异对监测结果影响大等原因，可能存在灵敏度低等缺点。

6 以蚤类为受试生物进行水质监测预警的研究进展

水蚤作为一种受试生物，在生物毒性监测方面取得了一定进展，它对多种有毒物质都很敏感，具有良好的重现性，是国际公认的一种标准毒性实验生物[58，62]。利用蚤类在受污染环境中的游动速度、高度以及运动轨迹，分析它在该环境中的形态、生理和行为的变化，可以对水体毒性进行初步判断，为水质在线生物监测预警提供实验基础[19，42,43，50]。蚤类中用于毒性研究最多的是大型溞，利用其体内酶活性的变化可以更早地检测出污染物的存在，有利于我们提前对受污染水体进行控制，抑制污染物的扩散[63]。在水蚤用于环境监测的评价指标分析中，通过研究水体富营养化对隆线溞的影响，发现隆线溞体内的乙酰胆碱酯酶的活性随受污染水体中三唑磷含量的增加而降低。另外，在研究重金属镉和锌的联合毒性作用时发现，蚤类体内的MT含量随镉和锌的联合浓度的升高呈现先上升后下降的趋势，在较低浓度时表现为协同作用，在中等浓度时表现为相加作用，在较高浓度时表现为拮抗作用，由此可知蚤类体内的MT物质可作为镉、锌联合毒性评价的敏感指标[64]。

蚤类的体积小、易观察、易培养且发生率高、繁殖周期短、对污染物敏感，具有良好的重现性[65]。此外，蚤类对杀虫剂敏感度较高，但是对除草剂敏感度低，且缺少标准毒理试验的标准方法[66]。在水蚤监测水质的实验中，通过分析水蚤在受污染环境中的繁殖率及死亡率可以得到较直观的实验结果，但测试的灵敏度、实验数据的准确性和可比性都会受到水蚤种类和年龄的影响，为此，需要对进行测试的水蚤的基因型、投喂的食物和水蚤培养所需的外界环境因素进行标准化的限定[64]。此外，以蚤类为探测生物的仪器通常存在误报警率高、维护难度大以及生物更换频繁等缺点。

7 以电化学活性微生物为受试生物进行水质监测预警的研究进展

目前用作毒性监测的生物传感器有DNA传感器、免疫传感器、微生物传感器和酶传感器。以电化学活性微生物为受试生物通常采用的是微生物传感器法。微生物传感器法包括固定化微生物、换能器和信号输出装置三部分，微生物活体是作为分子识别固定于电机表面的敏感材料的一种生物传感器，由于微生物本身包含多种酶系，利用其体内的各种酶系及代谢系统来检测和识别相应底物，就可以达到测试有毒物质综合毒性的目的。常见的生物活体包括细菌、真菌、酵母菌和动物细胞等[42]。目前已有的监测系统有美国乔治亚理工大学采用的利用中红外区域光纤消逝光谱测量待测微生物与对应标记物的相互作用的生物光电传感器系统[67]。系统的传感区域涂有特定的薄聚合物层形成疏水膜，可使疏水性分析物在传感器附近富集，减少对基质的干扰。该传感器能快速并实时测量且具有高灵敏度，不需要额外的步骤或消耗性试剂，并能够检测水和空气中各种化学和生物样本[68]。此外,英国研究国际公司和美国海军研究实验室研发的基于光纤的生物传感技术RAPTOR，是一套便携式快速自动荧光测定系统。该系统是集流体、光学、软件和电子于一体的独立结构，适用于生物毒素、爆炸物、生物和化学污染物的现场检测和实验室分析[67]。

以电化学活性微生物为受试生物的微生物传感器法通常具有灵敏度高、检测速度快以及操作维护简单等优点，但是也存在抗干扰能力差以及误报警率高等缺陷。

8 以多种生物联合为受试生物进行水质监测预警的研究进展

鉴于生物个体具有生理局限和敏感程度等限制因素，不同种类的水生生物对相同污染水体的响应差别巨大，往往在使用单一生物进行水质监测时容易存在错误报警或未及时报警的情况。因此，使用多物种在线预警技术能够更为全面、准确地反映水体污染事故中不同污染物的危害及其叠加效应，在一定程度上降低监测系统报警的失误率，还可以考虑到多种污染物造成的水体污染的综合影响[41,42]。多物种在线生物监测仪可以通过预先设定的方法，采用96种以内的生物种类同时进行水质监测，从而实现对水体内多种不同生物运动行为的在线监测。根据预先设定的各阈值，如果连续3次记录中的设定频率偏离正常值的百分率超过了警示阈值，生物监测仪就会发出预警信号，从而达到持续在线监测水质的目的。常见的监测技术有根据水体生物的呼吸频率监测水体污染的生物早期预警系统BEWs[6，69]以及与BEWs系统相似的运用四级阻抗技术的多物种生物监测仪，其中多物种生物监测仪MFB(Multispecies Freshwater Biomonitor)是一种较成熟的在线监测仪[6，70]。

利用多种生物同时进行水质监测预警，可以持续进行水环境质量的在线监测，几乎所有能够对环境胁迫产生行为反应的水生生物都可以用来监测水环境污染和突发性水体污染事故。因此，以多种生物联合作为探测生物可以极大程度地提高生物水质监测仪器的敏感性和选择性，降低误报警率。但由于生物物种过多导致维护成本较高，且需要掌握对不同种生物的观测分析技术及数据处理方法，因此操作难度较大[32，41]。此外，生物预警虽然可以在发生突发污染事件的时候发出及时的预警，但从定量角度确定污染因子的种类和污染量的能力较弱，但目前尚没有标准的生物监测体系，对于该领域的技术监督和仪器质检都还有巨大的发展空间。

9 结论

根据所选择的作为生物传感器的探测生物的不同，生物综合毒性监测设备的优缺点也不同。本文综述了常见的几种毒性监测设备的研究现状及其优缺点，通过对比发现：

(1)以鱼类为受试生物的监测系统可监测的污染范围较小，且设备维护成本较高；以发光细菌为受试生物的监测系统，不适用于较长时间段的全自动监测，且成本高、需定期更换菌种、维护周期较短；以藻类为受试生物的监测系统，对驯化人员的技术要求较高，对杀虫剂敏感度较低且不稳定，更换受试生物也较为频繁；以蚤类为受试生物的监测系统，对除草剂的敏感度低，需要频繁地更换受试生物，误报警率高、维护难度大；以电化学活性微生物为受试生物的监测系统，抗干扰能力差、误报警率高。

(2)以贝类为受试生物的监测系统，对重金属和农药等常见的生活及工业污染物都较敏感，能对自然水体水质的毒性变化进行中长期监测预警。另外，其使用和购买较便利、成本低、对个体发育程度要求不高、运动范围小、易于观察、更换周期长、不需要额外投喂食物、生存能力强、适应范围广、简单易行、在各个湖泊、水库以及河流流速较缓的水域都可利用现有的无线信号装置实现在线监测。

(3)目前悬浮式贝类生物监测预警系统还处于萌芽阶段，以贝类为受试生物的监测预警具有较大的发展前景。