4个产地大叶茜草重金属测定及品质评价

何世新， 张 华， 牟腊梅， 熊学庆， 阳文武*， 周 浓

(1.重庆市万州食品药品检验所，重庆 404000；2.重庆三峡学院生物与食品工程学院，重庆 404120)

大叶茜草为茜草科茜草属植物大叶茜草RubiaschumannianaPritz.的干燥根茎，又名土茜草、川茜草、西南茜草，1987年版《四川省中药材标准》原名“茜草”，为了与《中国药典》收载的茜草相区别，故更名为“大叶茜草”[1]，生长于海拔1 300～3 000 m处的山谷、山坡、路边林中或灌丛，主产于四川、云南、贵州、重庆等地，其性寒，味苦，归肝经，用于治疗吐血、衄血、崩漏出血、外伤出血、经闭瘀阻、关节痹痛、跌扑肿痛等疾病[2]，主要成分为蒽醌及其苷类、萘醌及其苷类、环己肽类化合物[3-4]，具有抗炎、抗肿瘤、解热、镇咳祛痰等药理作用，对心血管系统也有影响，药用价值很高[5]。因此，本实验参照2015年版《中国药典》四部通则项下规定，对来自四川、重庆、贵州、云南的8批大叶茜草中水分、总灰分、酸不溶性灰分进行测定[6]，HPLC法测定大叶茜草素含量，微波消解-电感耦合等离子体质谱测定重金属[铅(Pb)、镉(Cd)、汞(Hg)、砷(As)、铜(Cu)]含量，以期为该药材质量控制和品质评价提供依据。

1 材料

ICAP-Q型电感耦合等离子体质谱仪(美国Thermo公司)；LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；AB204S型天平(万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；MARS6型微波消解仪(美国CEM公司)；KH-2000DB型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；ED53型干燥箱(德国Binder公司)；SDLA-B-1101型超纯水机(重庆圣德利医疗器械研究有限公司)；SX2-5-12型电阻炉(重庆新特电炉设备厂)；HH-6型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)。Pb、Cd、Hg、As、Cu标准贮备液质量浓度均为1 000 μg/mL(国家有色金属及电子材料分析测试中心，批号分别为GSB04-1742-2004、GSB04-1721-2004、GSB04-1729-2004、GSB04-1714-2004、GSB04-1725-2004)。大叶茜草素对照品(中国食品药品检定研究院，批号110884-200604)。优质级硝酸(台湾联仕电子化学材料股份有限公司)；盐酸(成都科龙化工试剂厂)；甲醇为色谱纯(德国Merck公司)；水为超纯水；载气为99.99%高纯氩气。重金属含量测定所用玻璃仪器、容器在使用前，均先用20%硝酸浸泡24 h，再用超纯水洗净。大叶茜草采自四川、重庆、贵州、云南，经重庆市万州食品药品检验所张德伟副主任中药师鉴定为大叶茜草RubiaschumannianaPritz.的干燥根茎，清洗后35 ℃下烘干，粉碎过筛，备用。

2 方法与结果

2.1 重金属含量测定

2.1.1 分析条件 功率1.55 kW；模拟电压-1.775 kV；进样泵转速40 r/min；冷却气体积流量14 L/min；雾化气体积流量1.07 mL/min；采样深度5 mm，连续采样3次；跳峰采集模式。

2.1.2 标准溶液制备 取1 000 μg/mL Pb、Cd、As、Cu单标溶液适量，10%硝酸稀释成每1 mL含Pb、As 1、5、10、20、40 ng，Cd 0.5、2.5、5、10、20 ng，Cu 50、100、200、400、500 ng的溶液。另取1 000 μg/mL Hg单标溶液适量，10%硝酸稀释成每1 mL含Hg 0.2、0.5、1、1.5、2.0 ng的溶液，随行试剂为空白，在“2.1.1”项条件下进样测定。以重金属质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各重金属在各自范围内线性关系良好。

表1 各重金属线性关系

2.1.3 供试品溶液制备 取药材约0.3 g，精密称定，置于聚四氟乙烯消解罐中，加5 mL硝酸混匀，盖上内盖，旋紧外套，在微波消解炉中消解，程序见表2。消解完全后，用水转移至50 mL量瓶中，加入金标准溶液(1 μg/mL)200 μL，加水稀释至刻度，摇匀，即得。同法制备空白溶液。

表2 微波消解程序

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 精密度、重复性试验 取Pb、Cd、Hg、As、Cu中间治疗浓度标准溶液，在“2.1.1”项条件下进样测定6次，测得各重金属峰面积RSD分别为0.82%、0.93%、1.2%、0.91%、0.64%，表明仪器精密度良好。取药材(S3)，按“2.1.3”项下方法处理，在“2.1.1”项条件下进样测定6次，测得各重金属含量RSD分别为0.93%、0.82%、1.1%、0.83%、0.70%，表明该方法重复性良好。

2.1.4.2 加样回收率试验 精密称取药材(S3)6份，每份0.3 g，精密加入标准溶液，在“2.1.1”项条件下进样测定，测得各重金属加样回收率为86.7%～97.9%，RSD为0.90%～3.1%。

2.1.5 样品含量测定 结果见表3。根据《中医药-中药材重金属限量》ISO国际标准[7]，只有1批药材中Cd含量不符合要求，其余均合格；在2015年版《中国药典》限量值标准下[8]，Pb、Cd超标率分别为12.5%、100%，而Hg、As、Cu 均符合要求。

表3 各重金属含量测定结果

2.2 水分测定 参照2015年版《中国药典》四部[6]进行测定，结果见表4。

2.3 总灰分测定 参照2015年版《中国药典》四部[6]进行测定，结果见表4。

2.4 酸不溶性灰分测定 参照2015年版《中国药典》四部[6]进行测定，结果见表4。

表4 水分、总灰分、酸不溶性灰分测定结果

2.5 大叶茜草素含量测定

2.5.1 色谱条件与系统适用性试验 Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流动相甲醇-水(80∶20)；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长250 nm；进样量10 μL。在上述色谱条件下，大叶茜草素的保留时间为28.702 min，色谱峰分离度良好，见图1。

图1 大叶茜草素色谱图

2.5.2 对照品溶液制备与线性关系考察 精密称取大叶茜草素对照品0.012 07 g，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，得0.483 mg/mL对照品溶液，精密量取0.25、0.50、2.0、5.0、10.0 mL，置于20 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，即得0.006、0.012、0.048、0.121、0.242、0.483 mg/mL溶液。以大叶茜草素质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程为Y=4.744 8×107X+2.685 4×104(r=0.999 9)，在0.006～0.483 mg/mL范围内线性关系良好。

2.5.3 供试品溶液制备 取药材(S3)粉末约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，称定质量，浸泡过夜，超声(功率250 W、频率33 kHz)处理30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，滤过，取续滤液，即得。

2.5.4 方法学考察

2.5.4.1 精密度、重复性试验 精密吸取对照品溶液10 μL，在“2.5.1”项色谱条件下进样测得6次，测得大叶茜草素峰面积RSD为0.46%，表明仪器精密度良好。精密称取药材(S3)粉末6份，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.5.1”项色谱条件下进样测定，测得大叶茜草素含量RSD为0.72%，表明该方法重复性良好。

2.5.4.2 稳定性试验 取同一份供试品(S3)溶液，于0、4、8、12、16、20、24 h在“2.5.1”项色谱条件下进样测定，测得大叶茜草素峰面积RSD为0.88%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.4.3 加样回收率试验 取大叶茜草素含量已知(0.211%)的药材粉末6份，每份约0.5 g，精密称定，精密加入标准溶液2.0 mL，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.5.1”项色谱条件进下样测定，计算回收率。结果，大叶茜草素平均加样回收率为98.9%，RSD为0.93%。

2.5.5 样品含量测定 取不同产地药材粉末各约0.5 g，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，在“2.5.1”项色谱条件下进样测定，外标法计算含量，结果见表5。

表5 大叶茜草素含量测定结果

3 讨论

本实验发现，不同产地的药材重金属含量差异较大，与李若诗等[9]报道一致；除1批药材中Cd含量不符合《中医药-中药材重金属限量》ISO国际标准外[7]，其余均符合规定；根据2015年版《中国药典》限量值标准[8]，发现Pb、Cd超标，以后者更明显，是限量值的11.7倍，而Hg、As、Cu均符合相关要求，其原因可能与大叶茜草根对Cd元素的富集性相关[10]，需作进一步研究。本实验采用的微波消解-电感耦合等离子体质谱法快速准确，检出限低，可用于大叶茜草中重金属含量测定，从而更好地保证该药材安全性、有效性、可控性。水分、总灰分、酸不溶性灰分是评价药材品质的重要指标，而大叶茜草素是大叶茜草主要活性成分，本实验发现8批药材上述指标均符合2010年版《四川省中药材标准》[11]要求，其中四川西昌、凉山和重庆丰都所产药材中大叶茜草素含量较高，质量较好，可能与其在生长过程中受产地气候、环境、栽培方法等因素的影响有关。在含量测定时，本实验根据方乐敏、于瑞等[12-13]的方法，优化了色谱条件，未将毒性较大的四氢呋喃作为流动相，可保证安全性。另外，8批大叶茜草中几乎都未检出羟基茜草素，故未将其作为品质评价指标，但茜草中该成分含量较高，故可考虑将其作为辨别茜草和大叶茜草的特征成分，从而为打击药材混用提供新的检测指标。