结直肠癌组织TBX3表达及与上皮间充质转化相关分子表达的相关性

董明杰 周艳 段沫 高庆敏 赵建辉

(河北医科大学第二医院 1普外七科，河北 石家庄 050000；2检验科；3石家庄市正定县人民医院检验科)

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，也是世界第三高发恶性肿瘤，位于肺癌、乳腺癌之后。近十年数据显示，随着时间变化结直肠癌发病和死亡呈现上升趋势，因此降低结直肠癌发病与死亡仍是世界性的共同问题〔1〕。2018年结直肠癌诊疗指南中明确指出，应将结直肠癌患者纳入多学科写作(MDT)管理，实施整体治疗策略，因此有必要寻找新的标志物，并与目前结直肠癌患者临床生物学行为系统联合，以期为临床进行评估和诊断提供有效信息〔2〕。

T-box3基因(TBX3)属于T-box家族，在脊椎和非脊椎动物胚胎的形态和组织发生中起重要作用，研究发现乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、宫颈癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中检测出TBX3高表达〔3～6〕，但其作用及其机制尚不清楚。上皮间充质转化(EMT)是肿瘤浸润、侵袭和转移过程中的一个重要分子机制，在恶性肿瘤发生发展中的作用越来越受到重视。本研究检测TBX3和EMT相关分子在结直肠癌中的表达，探讨TBX3蛋白在上皮间充质转化中的作用，并分析两两之间的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年10月至2018年9月于河北医科大学第二医院普外七科住院手术的68例结直肠癌患者为研究对象，取结直肠肿瘤组织及癌旁组织标本进行研究检测，并完善病理资料。结直肠患者男41例，女27例，平均年龄(54.86±12.05)岁，本研究经医院伦理委员会批准，患者或其家属均签署知情同意书。

1.2主要试剂 TBX3兔抗人多克隆抗体购自Santa Cruz公司，E-钙黏蛋白(E-cadherin)、细胞角蛋白(Cytokeratin)20、波形蛋白(Vimentin)、TBX3引物及内参基因GAPDH引物由上海生工生物技术公司合成。

1.3Western印迹检测 取结直肠患者肿瘤组织及癌旁组织100 mg，细胞裂解液裂解，Bradford法测定组织细胞总蛋白，50 μg总蛋白液中加入聚丙烯酰胺凝胶缓冲液，水浴3～5 min进行蛋白变性，上样，进行凝胶电泳分离，半干法转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%牛奶室温封闭、加入TBX3一抗或内参β-actin一抗孵育过夜，洗膜后室温用辣根过氧化酶标记的二抗孵育反应，充分洗膜后显影曝光，对条带进行吸光度扫描，以目的蛋白/β-actin比值为相对表达量，进行半定量分析。

1.4实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测 取结直肠患者肿瘤组织及癌旁组织100 mg，进行qRT-PCR检测。具体步骤如下：PCR试剂盒提取肿瘤组织及癌旁组织的总RNA，鉴定其浓度和纯度，进一步利用试剂盒将RNA逆转录为cDNA，进行Real time PCR，检测目的基因mRNA表达水平。qPCR 反应引物序列见表1，反应条件为：预变性95℃ 15 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，70℃ 30 s，扩增40个循环。每个标本目的基因的循环阈值 Ct 用内参基因GAPDH来校正，以2-ΔΔCt方法分析目的基因的mRNA相对表达水平。

表1 PCR 引物序列

1.5统计学方法 采用SPSS13.0软件进行方差分析、t检验、Spearman相关分析。

2 结 果

2.1结直肠癌患者TBX3蛋白及mRNA表达情况 结直肠癌患者肿瘤标本组织中TBX3蛋白及mRNA表达明显高于癌旁组织(均P<0.001),见表2。

表2 结直肠癌患者TBX3蛋白和TBX3 mRNA表达

2.2结直肠癌患者E-cadherin、Cytokeratin 20、Vimentin mRNA表达 结直肠癌患者肿瘤标本组织中Cytokeratin 20、Vimentin mRNA表达明显高于癌旁组织，E-cadherin mRNA表达明显低于癌旁组织(均P<0.001)，见表3。

表3 结直肠癌患者E-cadherin、Cytokeratin 20、Vimentin mRNA表达

2.3结直肠癌患者TBX3表达与E-cadherin、Cytokeratin 20、Vimentin表达的关系 将结直肠癌患者进行二次分组，分为高TBX3蛋白表达组、低TBX3蛋白表达组，结果显示高TBX3表达组Cytokeratin 20、Vimentin mRNA表达明显高于低TBX3表达组，E-cadherin mRNA表达明显低于低TBX3表达组(均P<0.001)，见表4。

表4 结直肠癌患者E-cadherin、Cytokeratin 20、Vimentin mRNA表达

2.4结直肠癌患者TBX3、E-cadherin、Cytokeratin 20、Vimentin mRNA表达与患者临床病理特征之间的关系 TBX3、E-cadherin、Cytokeratin 20、Vimentin mRNA表达与结直肠癌患者临床分期、分化程度、淋巴结转移有关(均P<0.001)，见表5。

表5 结直肠癌患者TBX3、E-cadherin、Cytokeratin 20、Vimentin mRNA表达与临床病理特征的关系

2.5结直肠癌患者TBX3与E-cadherin、Cytokeratin 20、Vimentin表达的相关性 肿瘤组织中TBX3与Cytokeratin 20(r=0.757)、Vimentin(r=0.677)呈正相关，TBX3与E-cadherin(r=-0.717)呈负相关(均P<0.001)。

3 讨 论

TBX3是TBX基因家族的成员之一，该家族属发育调控相关转录因子基因家族，在脊椎和非脊椎动物胚胎的形态和组织中发挥着重要作用〔7〕。研究表明，在不同的肿瘤组织和细胞株中可检测到TBX3过表达，如乳腺癌、肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、肉瘤和宫颈癌等，TBX3异常高表达与肿瘤细胞的侵袭和转移有关〔8，9〕。Feng等〔10〕采用免疫印迹法技术检测新鲜结直肠癌及相应的癌旁组织TBX3 表达的情况，发现 TBX3 基因在癌组织中的表达水平高于癌旁组织。本研究结果提示结直肠癌患者中TBX3高表达。进一步对TBX3表达与结直肠癌患者的临床病理因素进行分析，TBX3与结直肠癌临床分期、分化程度、淋巴结转移有关，临床分期晚、分化程度高、淋巴结转移阳性的患者肿瘤组织TBX3表达越高。

EMT与肿瘤的转移密切相关，是恶性肿瘤细胞获得较强侵袭及迁移能力等恶性行为的重要生物学过程，处于EMT 的上皮细胞在经历短暂的结构改变后极性丧失，与周围细胞和基质的接触减少，细胞迁移和运动能力增强，上皮细胞表型如E-cadherin及Cytokeratin等蛋白表达丢失，而表达一些间质细胞表型如 Vimentin、Fibronectin及 N-cadherin 等〔11～15〕。本研究结果表明，EMT相关蛋白在结直肠癌发生与发展中表达的变化具有一定的生物学意义，EMT相关蛋白表达与结直肠癌患者临床分期、分化程度、淋巴结转移有关，与性别、年龄无明显关系。

本研究结果提示TBX3表达变化与结直肠癌EMT有关，高TBX3表达可促使结直肠癌浸润、侵袭和转移。