miR-335-5p和ATF2在宫颈癌中表达及临床意义

彭丽娟 任俊奇

(1武汉市东西湖区人民医院妇科，湖北 武汉 430040；2武汉大学人民医院病理科)

宫颈癌多发于中年妇女〔1～3〕，严重影响女性生活质量及生命安全，早期筛查和诊断并尽早介入治疗，是降低宫颈癌死亡率的关键。miRNA是一种内源性非编码小分子RNA，可以通过作用于靶基因调控细胞增殖、迁移、等代谢活动。研究发现，miR-335可能在宫颈癌发病中发挥类似抑癌基因的作用，但其对下游靶基因的调控机制尚未明确〔4〕。激活转录因子(ATF)2属于碱性亮氨酸拉链蛋白家族，研究发现〔5〕，ATF2靶基因包括c-Jun、肿瘤坏死因子(TNF)α、细胞周期蛋白(Cyclin)A等，在细胞凋亡中发挥重要作用。然而，关于ATF2在宫颈癌中相关研究还未见，因此本研究通过检测miR-335-5p和转录因子ATF2在宫颈癌组织和健康宫颈组织中的表达水平，探究其表达特点并分析临床意义。

1 材料与方法

1.1标本及临床资料 从2014年3月至2016年3月在武汉市东西湖区人民医院存档的宫颈组织石蜡包埋标本中随机选取150例，均为手术标本，其中宫颈癌组织75例，均为成年女性，且术前均未接受放化疗或其他抗肿瘤治疗。年龄35～64岁，平均年龄(50.58±7.62)岁；2000年国际妇产科联盟临床分期(FIGO)：Ⅰ期23例，Ⅱ期41例；Ⅲ期10例；Ⅳ期1例；鳞状细胞癌43例，腺癌22例，鳞腺癌10例；肿瘤分化程度：高分化22例，中分化34例，低分化19例；有淋巴结转移39例，无淋巴结转移36例；肿瘤直径：0.65～5.91 cm，平均直径(3.54±1.68)cm。对照组75例，均来自同期接受子宫肌瘤全子宫切除术的成年女性，且未接受其他手术或药物治疗。年龄37～63岁，平均年龄(56.83±9.25)岁。实验组与对照组在年龄上差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院道德伦理委员会批准通过，样品采集均取得患者及家属知情同意并签字，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2主要试剂与仪器 RNA提取试剂盒，购自于北京天根生化有限公司；AceQ qPCR SYBR®Green Mix，购自南京vazyme生物公司；引物由上海生工生物公司等合成。qRT-PCR仪购自美国Bio-Rad公司等；Anti-ATF2、Anti-β-actin购自abcam公司；ATF-2 (N-96) 兔多克隆抗体(sc-6233)购自美国Proteintech公司；二氨基联苯胺(DAB)酶底物显色试剂盒与SP试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3qRT-PCR法检测宫颈癌组织和健康宫颈组织miR-335-5p水平 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测实验组与对照组宫颈组织中miR-335-5p表达水平。采用RNA提取试剂盒(天根)提取宫颈癌组织和健康宫颈组织总RNA，反转录得cDNA。采用定量PCR仪(Bio-Rad)对miR-335-5p进行扩增。qRT-PCR体系共10 μl：miScript SYBR®Green Mix 5 μl，cDNA(50 ng/μl)1μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，ddH2O 3.0 μl。反应条件：95℃，90 s；95℃，30 s；63℃，30 s；72℃，15 s；40个循环。miR-335-5p正向引物:5′-GAGTTGACCACAGCACCTC-3′,反向引物5′-GAGACAGTTCTCGTTATTGC-3′;U6正向引物：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。采用2-ΔΔCt法对miR-335-5p表达水平进行定量分析。

1.4Western印迹法检测AFT2蛋白表达情况 提取实验组与对照组组织总蛋白，并测定蛋白总量。以β-actin蛋白作为内参，采用Western印迹法检测ATF2蛋白表达情况，操作严格按照试剂盒说明书进行。利用Lab Works对检测条带定量分析，测定条带光密度，ATF2蛋白相对表达量=ATF2蛋白光密度值/β-actin蛋白光密度值。

1.5免疫组化染色 采用免疫组化法检测各组织标本中ATF2的表达水平。主要操作步骤如下：①将宫颈组织标本采用石蜡切片机切成厚度为4 μm的切片，展片后于60℃烘烤1 h；②将切片依次置于二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中进行常规脱蜡至水；③通过在pH6.0浓度为0.01 mol/L的枸橼酸钠缓冲液中煮沸18 min进行抗原热修复；④在切片上滴加3%过氧化氢，于室温孵育10 min灭活组织中的内源性过氧化物酶；⑤采用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗切片3 min×3次，滴加1%的牛血清白蛋白，孵育50 min封闭非特异性结合位点；⑥吸弃封闭液(阴性对照除外)，滴加预先按说明书1∶200比例稀释的兔多克隆抗体ATF2，置于湿盒中4℃孵育过夜；⑦PBS冲洗切片3次，每次5 min，加生物素标记的二抗工作液，37℃孵育40 min。⑧PBS冲洗切片5 min×3次，常规DAB显色，并采用10%的苏木素进行复染；⑨将切片依次置入70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇中进行梯度脱水，置于二甲苯中透明，并采用中性树胶封片，于显微镜下观察拍照。

1.6结果判定 免疫组化染色结果中ATF2蛋白以胞核或胞质中出现棕黄色颗粒为阳性表达。采用Bresalier双评分半定量法对免疫组化阳性结果进行判定，即由阳性肿瘤细胞所占比例和染色强度共同决定，其中染色强度评分：0分(无染色)，1分(弱染色，浅黄色)，2分(中染色，黄褐色)，3分(强染色，棕褐色)；阳性肿瘤细胞所占比例评分：0分(<25%)，1分(25%～50%)，2分(51%～75%)，3分(>75%)。染色强度与阳性细胞所占比例的评分乘积即为染色指数(SI)，每个标本的评估均由3名专业人员进行评定取平均值，SI评分为0～9分，其中SI≤1分为阴性(-)；1分

1.7随访 对所有治疗出院后的患者每3个月进行复查或电话随访，随访时间为36个月，末次随访时间截止2019年3月1日，死亡患者以死亡时间作为随访截止期，本次随访的中位随访时间为30个月。观察记录患者随访期间肿瘤复发情况、生存情况。

1.8统计学方法 采用软件SPSS23.0软件进行t检验、χ2检验、秩和检验。

2 结 果

2.1miR-335-5p在宫颈癌组织、对照组中表达水平 实验组miR-335-5p表达相对于对照组显著下调(0.68±0.12 vs 1.03±0.19;P<0.05)。

2.2Western印迹法检测ATF2蛋白表达情况 实验组ATF2蛋白表达水平显著高于对照组(0.96±0.02 vs 0.23±0.05;P<0.05)。

2.3ATF2在对照组及实验组中的表达 实验组ATF2的阳性表达率(53.33%，+16例、21例、3例)显著高于对照组(4.00%，+2例、1例，χ2=44.632，P=0.000)。

2.4miR-335-5p和ATF2表达与宫颈癌临床病理特征的关系 宫颈癌患者miR-335-5p表达水平与肿瘤分化程度、淋巴结转移和人乳头瘤病毒(HPV)感染有关(P<0.05)，与患者年龄、FIGO分期、病理分型和肿瘤直径无明显相关性(P>0.05)；宫颈癌患者中ATF2表达水平与FIGO分期、肿瘤分化程度和淋巴结转移相关(P<0.05)，与患者年龄、肿瘤直径、病理类型和HPV感染无明显相关性(P>0.05)，见表1。

2.5miR-335-5p、ATF2与宫颈癌患者预后的关系 宫颈癌组织中miR-335-5p低表达的患者术后肿瘤复发率及死亡率均显著高于miR-335-5p高表达组(P<0.05)；宫颈癌组织中ATF2高表达的患者术后肿瘤复发率及死亡率均显著高于ATF2低表达组(P<0.05)，见表1。

表1 miR-335-5p和ATF2与宫颈癌临床病理特征的关系(n，n=75)

3 讨 论

宫颈癌发病原因有许多，常见病因为HPV感染〔6〕，因此通过注射HPV疫苗或HPV感染源筛选预测罹患宫颈癌风险，是降低宫颈癌死亡率的有效方法。宫颈癌多发于中年妇女，近年呈年轻化趋势，宫颈细胞学筛查的应用使宫颈癌患者得以尽早发现确诊，介入治疗，但是细胞学筛查方法依靠检测人员的主观判断，具有一定局限性，寻找分子生物学方法更有利于宫颈癌患者的精确筛选。

miRNA没有编码蛋白质的作用，但能够通过和靶基因mRNA结合抑制其翻译或者直接使其降解，达到在转录水平上调控基因表达的作用〔7〕。miR-335-5p属于miR-335家族，位于染色体7q32.2，miR-335-5p在许多研究中已被证实与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭转移及化疗耐药等密切相关〔8～10〕。研究发现〔11〕，miR-335-5p在骨肉瘤、肝癌、甲状腺癌及胃癌等恶性肿瘤中表达水平较低，能抑制肿瘤细胞持续的生长和转移。秦海霞等〔12〕研究发现miR-335在宫颈癌细胞系SiHa中表达显著降低，可抑制宫颈癌细胞侵袭及迁移。与以上结果相似，本研究发现miR-335-5p在宫颈癌中表达显著下调，说明miR-335-5p可能与宫颈癌有关。张梨虹等〔13〕通过qRT-PCR检测发现，8-氯腺苷(Cl-Ado)可以通过下调RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)1负向调控miR-335-5p抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移，miR-335-5p在乳腺癌中可能作为抑癌基因。本研究结果说明miR-335-5p可能参与宫颈癌的发展过程，miR-335-5p的表达水平降低可能与宫颈癌复发、死亡等不良预后有关。

活化转录因子(ATF)2位于人14号染色体，ATF2的过表达能够抑制细胞周期抑制因子P21、P27的表达，促进原癌基因CyclinD1的激活〔14〕，Li等〔15〕研究证实宫颈癌细胞中ATF表达量高于正常宫颈细胞，过表达miR-204可下调ATF表达量，是治疗宫颈癌的理想靶点。与其研究结果一致，本研究发现宫颈癌组织中ATF2表达水平显著高于健康宫颈组织，提示ATF2可能与宫颈癌病变有关。王成等〔16〕研究显示，ATF-2是ATF/腺苷酸环化酶(CAMP)反应成分结合蛋白家族成员，具有生长因子非依赖性增殖和转化能力。刘建云等〔17〕研究发现ATF2可激活在肿瘤细胞内异常活跃的泛素水解酶22启动子的转录活性，在肿瘤发生发展过程中起重要作用。本研究结果提示ATF2可能与宫颈癌患者病情发展有关,ATF2高表达可能与宫颈癌患者不良预后有关。

综上所述，宫颈癌组织miR-335-5p相对于健康宫颈组织表达下调、ATF2表达上调，与淋巴结转移及肿瘤分化程度等临床病理特征及术后复发生存情况有关，本研究未对miR-335-5p、ATF2与宫颈癌的发生发展中的具体作用关系进一步探索，将在后续实验中借助细胞学实验进行完善。