不同酵母发酵对柿子酒、柿子醋风味的影响

陈 颖，陈晓明，张志军，刘 勋，王占文，张 峻,*

（1. 天津市农业科学院农产品保鲜与加工技术研究所，天津 300384；2. 天津蓟州绿色食品集团有限公司，天津 301900）

柿子（Diospyros kaki Thunb.），又名长生果，属柿树科柿属植物，其味甘、性寒，能清热生津、润肺，内含蛋白质、糖类、脂肪、果胶及多种维生素和矿物质，具有较高的营养价值和药用价值[1]。盘山磨盘柿作为天津市地理标志保护产品，主要分布于天津市蓟州区北部山区，具有品质优、风味佳等特点。

柿子醋作为一种柿子深加工产品，采用柿子原浆酿造而成，不仅可以保留柿子原果香气，同时溶解了柿子中的有机酸、维生素、氨基酸等多种营养成分，补充了粮食醋中矿物质含量的不足，具有较高的营养价值及保健功能[2]。

本系统服务器端即为教师端，而客户端即为学生端。但是一般Client/Server结构系统在应用前都需要进行系统部署、设置和调试工作，很多情况下，Client/Server架构数据库也需要进行一系列参数设置和环境设置，譬如连接时数据库就至少需要配置连接字符串。由于网络环境不同，连接字符串并非固定不变的，因此往往专业人员上门进行部署和测试。

传统柿子醋发酵工艺一般采用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）发酵后再接种醋酸菌完成醋酸发酵，发酵过程中产生的芳香物质相对较少，导致柿子醋风味淡薄、典型性香气不够浓郁。因此，增加柿子醋的天然香气成分对于提升柿子加工品品质有着非常重要的意义。有研究表明，一些非酿酒酵母（Non-Saccharomyces cerevisiae）在果酒的发酵过程中对果酒香气的整体特征具有重要影响[3-4]。非酿酒酵母菌是指存在于水果表皮、果园土壤甚至发酵设备上的参与果酒发酵，对果酒品质（口感、色泽、风味、营养物质等）产生重要影响的一类酵母菌的总称[5]。目前常用的主要非酿酒酵母包括假丝酵母属（Candida）、汉逊酵母属（Hansenual）、有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）、毕赤酵母属（Pichia）、接合酵母属（Zygosaccharomyces）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）、有孢圆酵母属（Torulaspora）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、克勒克酵母属（Kloeckera）和梅奇酵母属（Metschnikowia）[6-7]。 其中， 马 克 斯 克 鲁 维 酵母（Kluyveromyces marxianus）作为“天然香气的生产工厂”引起众多学者的关注[8]。马克斯克鲁维酵母来源极其广泛，具有较高的代谢多样性和种类多态性，其底物宽泛、生长速度快、耐热性强、安全性好、且具有高产乙酸乙酯等多种风味物质的能力。大量研究表明，马克斯克鲁维酵母可以分泌菊粉酶（能够水解β-2,1-果糖糖苷键）、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、木糖酶、氨肽酶等十多种水解酶类，在果酒发酵中，其可通过新的代谢途径产生新的不同于其他酵母的产物，对果酒的品质产生重要影响[9-10]。因此，近年来马克斯克鲁维酵母被作为“天然香料的生产者”应用于诸多生物技术领域[11-13]，而将马克斯克鲁维酵母用于柿子酒、柿子醋发酵的报道至今尚未发现。

(1)提出一种基于MATLAB的动态位移监测图像处理方法。对预处理后的图像进行形心算法计算得到形心坐标，最后通过位移计算公式得到动态位移。测得的位移与实际位移误差在一个像素对应的实际距离内。

本研究以盘山磨盘柿为原料，分别采用非酿酒酵母（马克斯克鲁维酵母）和酿酒酵母（安琪酿酒酵母）联合醋酸菌进行发酵，最终获得两种不同风味的柿子酒和两种柿子醋。通过顶空固相微萃取（HS-SPME）与气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术比较分析两种酵母发酵的柿子酒、柿子醋中主要芳香物质的变化，以期为工业化生产果酒及果醋提供一些理论依据。

嵊县气候温和，雨量丰沛，盛产各种翠竹，早在2 000多年前，就有竹篮、竹箩的编织，在光绪年间达到鼎盛时期，后来逐渐形成了典雅精美的竹编工艺特色，达到了“中外竹编第一家”的境界，外销国内外各地，发展迅速。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

醋酸菌活化：将保存于4 ℃条件下的沪酿1.01醋酸菌菌种，无菌条件下接种于已灭菌的液体培养基（培养基配方为：葡萄糖1%，酵母粉1%，无水乙醇4%）中，置于摇床中30 ℃、160 r/min 培养3 d。

通过图形用户接口（Graphical User Interface，GUI），实现网络插补实验教学的交互性。使用鼠标或键盘来选择菜单或按钮以引发程序内的特定操作行为，每个交互操作都会引发不同的程序行为。在操作之前，并不知道下一步要执行哪条程序代码。对每个操作行为，操作系统将决定在计算机上当前运行哪个程序对它进行处理，这一过程需要事件驱动程序的加载。

果胶酶（30 000 U/g），天津诺奥酶生产力促进有限公司产品；白砂糖，上海上棠食品有限公司产品；焦亚硫酸钾，安徽中弘生物工程有限公司产品；2-辛醇，Sigma 公司产品；蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司产品；葡萄糖、氯化钠、无水乙醇，天津市光复科技发展有限公司产品；麦芽糖、乳糖、酵母粉，北京鼎国生物技术发展中心产品。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、安琪葡萄酒活性干酵母BV818，安琪酵母有限公司；马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）、MPS1 菌株，本实验室保藏；巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）、沪酿1.01，本实验室保藏。

1.1.2 仪器与设备

CAV214C 型电子天平，奥豪斯仪器有限公司；JYL-D055 型水果打浆机，九阳股份有限公司；TZ-62手持糖度计，泉州光学仪器厂；SW-CJ-2FD 型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；LRH-70 型生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；GL21M 型离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Thermo Trace1300 气相色谱仪、ISQ7000 质谱仪，赛默飞世尔科技公司。

1.2 方法

一年一度的全国水利厅局长会议是水利工作的航塔。翻读近几年的工作报告，“民生水利”这一关键词频频提及，成为社会各界关注的热点。

柿子酒：磨盘柿挑选→清洗→脱涩→破碎打浆→酶解→调整成分（调糖）→酒精发酵过滤→柿子酒

柿子醋：柿子酒→醋酸发酵→过滤→柿子醋

1.2.3 测定项目与方法

1.2.2.1 原料挑选

挑选新鲜无病虫害、霉变和机械损伤的磨盘柿。

1.2.3.2 挥发性成分

将柿果分层装入容器中，均匀喷洒75%乙醇，用量为柿果质量的0.1%，常温下密封5～7 d。

1.2.2.3 酶解

挥发性物质定量分析：根据内标法（内标物：2-辛醇，终浓度为145 μg/L）计算待测组分含量。

将上述脱涩后的柿子破碎打浆后，加入5%（m/m）果胶酶，室温酶解12 h。

1.2.2.4 调整成分

网络培训四要素（PMCT）是一个有机的整体，缺一不可，平台是网络培训的基础，没有这个基础，其他都是无本之末，无源之水；内容是网络培训的核心，工具是网络培训的手段，管理是网络培训的关键，可见，网络培训四要素（PMCT）相互依存，互为促进。

用蔗糖将酶解后的柿子浆可溶性固形物含量调整至19～20%（m/m），加入0.01%（m/m）焦亚硫酸钾。

1.2.2.5 菌种活化

酿酒酵母的活化：将柿子汁稀释至可溶性固形物含量为5%，灭菌后降温至30 ℃，加入安琪葡萄酒活性干酵母BV818 活化30 min，每10 min 搅拌1 次。

(1)LVQ神经网络可以很好地实现对地下水源热泵系统EER等级划分的预测，并能清楚地计算该系统的节能等级，对以后系统在节能方面的完善奠定了一定的基础。

马克斯克鲁维酵母的活化：将保存于4 ℃条件下的MPS1 菌种于无菌条件下接种于已灭菌的液体培养基（培养基配方为：葡萄糖2%，麦芽糖1%，乳糖0.5%，蛋白胨0.5%）中，30 ℃恒温条件下培养2～3 d。

盘山磨盘柿，由天津蓟州绿色食品集团有限公司提供。

1.2.2.6 酒精发酵

分别将活化后的安琪酵母和马克斯克鲁维酵母以0.05%（m/m）的接种量接种于已调好成分的柿子果浆中，28 ℃培养至可溶性固形物含量不再降低时结束发酵。发酵结束后，分离沉淀物，得到酒醪。

1.2.2.7 醋酸发酵

1.2.1 工艺流程

在酒醪中加入5%醋酸菌种子液，4 层纱布封口，30 ℃静置培养。每24 h 取样检测，待样品总酸含量（以醋酸计）不再上升时结束发酵。

③结合信息化管理工具，实现对小流域高分辨率卫星数据、基础地理信息与规划设计信息的统一化管理、多角度查询统计及全方位综合展示，为生态清洁小流域的规划管理提供科学、有效的辅助手段。

1.2.2.8 过滤处理

3）当流量为40～60m3/h（标准状态下）时，功率应采用大于70kW，而当流量为30m3/h（标准状态下）时，功率应采用50～60kW，一般情况下尽量不采用40kW的功率。

酒精发酵和醋酸发酵结束后用硅藻土过滤发酵液，得到柿子酒及醋澄清液。

1.2.2 操作要点

1.2.3.1 理化指标

可溶性固形物含量：参照GB/T 12143—2008[14]规定的方法进行测定。

总酸含量：参照GB 12456—2021[15]规定的方法进行测定。

酒精度：参照GB 5009.225—2016[16]，采用酒精蒸馏法进行测定。

其中，ρ为介质密度，ut为水平位移速度，wt为垂直位移速度， τxx，τzz为正应力，τxz为剪应力，λ，μ为介质的拉梅系数；c11=c33=λ+2μ，c13=λ，c44=μ。

1.2.2.2 脱涩

GC-MS 条件：色谱柱为HP-INNOWAX（长30 m，内径0.25 mm，液膜厚度0.25 μm）。载气为高纯氦气，流速为1 mL/min。固相微萃取采用自动进样，不分流模式。柱温箱的升温程序为：40 ℃保持2 min，然后以5 ℃/min 的速度升温至140 ℃保持1 min，再以20 ℃/min 的速度升温至220 ℃保持14 min。质谱传输线温度为250 ℃，离子源温度为200 ℃，电离方式EI，离子能量70 eV，扫描范围为35～550 U。

挥发性成分提取：采用顶空固相微萃取法（HSSPME）进行提取。①样品制备：准确量取8 mL 柿子酒（柿子醋）于20 mL 顶空瓶中，加入2.4 g NaCl 及终浓度为145 μg/L 的2-辛醇；②萃取头活化：萃取头材质为聚二甲基硅氧烷/碳筛/二乙烯苯（PDMS/CAR/DVB），活化条件为孵化炉温度40 ℃，孵化时间10 min；③取样：将进样器插入顶空瓶于40 ℃恒温下吸附30 min；④进样：将萃取头插入GC-MS 进样口，250 ℃下热解析2 min 后进样。

四、尤其是对裁负有文化特征或符号的母材(如瓷、铜质等等)，改良和否定后产生的能源力更具有品值和品德。从而也引领了对雕塑本体的习惯势力，而进入它的当下状态及症侯。

挥发性物质定性分析：选择匹配因子大于或等于80%的色谱峰，各组分质谱由质谱数据库NIST 11s.LIB 和Wiley 7.LIB 检索并进行定性分析。

这话鬼才信呢。林老板找我绝对不会有好事。我说夏俊，你要找我叙旧，我一定奉陪，但林老板找我，恕我不能奉陪。夏俊有点急，说实话对你说了吧，你现在缺抛光熟手么？林老板可以帮你。

待测组分含量（μg/L）=对应组分峰面积×内标物含量（μg/L）/内标物峰面积

2 结果与分析

2.1 柿子酒及柿子醋总挥发性物质组成

安琪酵母发酵的柿子酒发酵至酒精度为6.8%时接入5%醋酸菌进行醋酸发酵，发酵结束后总酸为35.6 g/L（以醋酸计）。马克斯克鲁维酵母发酵的柿子酒发酵至酒精度为6.5%时，接入5%醋酸菌进行醋酸发酵，发酵结束后总酸为38.2 g/L（以醋酸计）。分别取样进行SPME 与GC-MS 分析，得到的总离子流图（图1～4）。

图1 安琪酵母发酵柿子酒总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of persimmon wine fermented with Angel yeast

分别对安琪酵母和马克斯克鲁维酵母发酵的柿子酒、柿子醋中的主要芳香成分进行定性和定量分析，结果见表1。

由表1 可知，在柿子酒和柿子醋中检测出的挥发性物质包括醇类、酸类、酯类、醛类、酮类，其中醇类物质和酯类物质为柿子酒中的主要挥发性物质，酸类和醇类为柿子醋中的主要挥发性物质。

表1 柿子酒及柿子醋中挥发性物质组成Table 1 Volatile substances compositions of persimmon wine and vinegar

图2 马克斯克鲁维酵母发酵柿子酒总离子流图Fig.2 Total ion chromatogram of persimmon wine fermented with K. marxianus

图3 安琪酵母发酵柿子醋总离子流图Fig.3 Total ion chromatogram of persimmon vinegar fermented with Angel yeast

图4 马克斯克鲁维酵母发酵柿子醋总离子流图Fig.4 Total ion chromatogram of persimmon vinegar fermented with K. marxianus

从GC-MS 检测出的挥发性物质数量上看，以安琪酵母发酵的柿子酒共检测出挥发性物质19 种，以马克斯克鲁维酵母发酵的柿子酒中共检测出挥发性物质29 种。以上结果表明，马克斯克鲁维酵母在柿子酒发酵过程中可产生更为丰富的香气成分。从挥发性物质的总含量上看，以马克斯克鲁维酵母发酵的柿子酒挥发性物质总含量较安琪酵母发酵柿子酒增加了56.42%，其中醇类物质和酯类物质增加较为显著，分别增加了55.67%和50.22%。

分别采用安琪酵母和马克斯克鲁维酵母发酵的柿子酒接种醋酸菌发酵的柿子醋中，挥发性物质分别为21和22 种。采用马克斯鲁维酵母发酵的柿子醋挥发性物质总含量较安琪酵母发酵所得柿子醋增加了18.95%，其中酯类和醇类物质分别增加了46.67%和44.21%。

上述结果可以看出，马克斯克鲁维酵母能明显提高柿子酒和柿子醋的香气成分含量。

2.2 柿子酒及柿子醋中各类挥发性物质分析

2.2.1 柿子酒及柿子醋中挥发性醇类物质

由表2 可以看出，以马克斯克鲁维酵母发酵的柿子酒中醇类物质比安琪酵母发酵的样品增加了6 种新物质。两种酵母发酵的柿子酒中含量最高的醇类物质均为3-甲基-1-丁醇（异戊醇），其含量分别占总醇类物质的55.70%（安琪酵母）和53.11%（马克斯克鲁维酵母），其次为苯乙醇。以马克斯克鲁维酵母发酵的柿子酒中所有两者共同拥有的醇类物质的含量均较安琪酵母发酵的样品有不同程度的提高，其中苯乙醇和3-甲基-1-丁醇提高最为明显，分别提高了57.64%和48.42%，该两种醇均为柿子酒中的典型性香气物质[17]。由此可见，以马克斯克鲁维酵母发酵可增强柿子酒的典型性香气。

表2 柿子酒及柿子醋中挥发性醇类物质组成及含量Table 2 Compositions and contents of volatile alcohols in persimmon wine and vinegar 单位：μg·L-1

两种不同酵母发酵的柿子醋中检测出的挥发性醇类物质中含量最高的均为苯乙醇，分别占柿子醋中总挥发醇类的77.14%和82.15%。除2-甲基-1-丁醇外，以马克斯克鲁维酵母发酵的柿子醋中的醇类物质含量均较安琪酵母发酵的柿子醋有所提高，其中柿子醋中的主要香气贡献者苯乙醇（具有玫瑰香味和蜂蜜香）的含量提高了53.57%，为改善柿子醋的风味起到了积极作用[18]。

2.2.2 柿子酒及柿子醋中挥发性酸类物质

由表3 可以看出，以两种不同酵母发酵的柿子酒中检测出的挥发性酸类物质为辛酸、正癸酸和己酸，与已有报道一致[19-21]。以马克斯克鲁维酵母发酵的样品中酸类物质含量较安琪酵母发酵样品增加了79.27%，其中正癸酸含量增加最为明显，较安琪酵母发酵样品增加了163.16%。

挥发性酸类物质是柿子醋中的主要挥发性物质。两种不同酵母发酵的柿子醋中检测出的挥发性酸类物质均为7 种。由表3 可知，两种柿子醋中含量较高的酸性物质均为乙酸、辛酸、正癸酸和3-甲基-1-丁酸。从柿子醋挥发性酸类物质总含量来看，马克斯克鲁维酵母发酵的柿子醋（1 105.98 μg/L）大于安琪酵母发酵的柿子醋（998.78 μg/L）。

表3 柿子酒及柿子醋中挥发性酸类物质组成及含量Table 3 Compositions and contents of volatile acids in persimmon wine and vinegar 单位：μg·L-1

2.2.3 柿子酒及柿子醋中挥发性酯类物质

酯类化合物是构成芳香成分的重要物质，具有独特的水果香气[22]。由表4 可知，辛酸乙酯、正己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异戊酯为两种不同酵母发酵的柿子酒中的主要酯类物质。马克斯克鲁维酵母在提高柿子酒酯类物质含量上具有重要作用，以马克斯克鲁维酵母发酵的柿子酒中大部分酯类物质的含量均较安琪酵母发酵的柿子酒有所提高，其中乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯含量分别提高了147.13%、91.96%和78.60%。

表4 柿子酒及柿子醋中挥发性酯类物质组成与含量Table 4 Compositions and contents of volatile esters in persimmon wine and vinegar 单位：μg·L-1

安琪酵母和马克斯克鲁维酵母发酵的柿子醋中的酯类物质总含量分别为49.18 μg/L 和72.12 μg/L，均明显低于柿子酒。在两种柿子醋中含量最高的酯类物质分别为乙酸苯乙酯和癸酸乙酯。以马克斯克鲁维发酵的柿子醋中，除乙酸苯乙酯外，其余酯类物质含量均较安琪酵母发酵的柿子醋有所提高，其中，月桂酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯含量分别提高了177.91%、137.36%和110.37%。马克斯克鲁维酵母发酵的柿子醋较安琪酵母发酵的样品新增3 种酯类物质，分别为苯乙酸乙酯、2-甲基-1-丁醇乙酸酯和9-十六碳烯酸乙酯，一定程度上丰富了柿子醋的风味。

独立学院办学的时间不长，学校本身和学生对就业指导课的重视程度都不够，大家都注重专业课、英语、计算机和一些基础课程的学习,轻视就业指导课的学习。就业指导课开设的课时不够，上课的内容就不够系统、深入，不成体系，对学生的职业规划、创业教育、就业指导等知识传授得不够，有些课程内容没有开设。把大学生就业指导贯穿于大学教育全过程，这是一个完整的教学计划，实施计划的有效模式是建立就业指导课程体系，这个体系应包括在学校的教学体系之中[3]。

2.2.4 柿子酒及柿子醋中挥发性醛、酮类物质

两种不同酵母发酵的柿子酒中醛类和酮类物质差异较大（见表5）。其中，以马克斯克鲁维酵母发酵的柿子酒中检测出4 种酮类物质和1 种醛类物质，醛、酮总含量为56.70 μg/L，而这5 种物质在安琪酵母发酵的柿子酒中均未被检测出。

表5 柿子酒及柿子醋中挥发性醛、酮类物质组成及含量Table 5 Compositions and contents of volatile aldehydes and ketones in persimmon wine and vinegar 单位：μg·L-1

3-羟基-2-丁酮和苯甲醛分别为两种柿子醋中含量最高的酮醛类物质，以马克斯克鲁维酵母发酵的柿子醋中3,4-二甲基苯甲醛含量较安琪酵母发酵的柿子醋提高了375%，其余两种酮醛类物质含量均较安琪酵母发酵的样品有所降低。柿子醋与柿子酒在醛类和酮类物质的组成上的较大差异，表明醋酸菌在发酵过程中形成了新的醛酮类物质。

3 结论

本文以盘山磨盘柿为原料，采用两种酵母菌——酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母分别酿造柿子酒和柿子醋，通过HS-SPME 与GC-MS 技术检测不同柿子酒和柿子醋中主要香气物质（匹配度大于或等于80%）的组成。

经定性和定量分析，柿子酒中的主要香气物质为醇类和酯类；酸类和醇类物质为柿子醋中的主要香气物质。以马克斯克鲁维酵母发酵的柿子酒在香气物质种类和总含量上均明显优于安琪酵母；马克斯克鲁维酵母发酵的柿子醋虽然在香气总含量上较安琪酵母未有显著增加，但是对于柿子醋的一些主要香气物质（如正癸酸、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等）含量的提高起到了积极的作用。

结合柿子酒和柿子醋来看，马克斯克鲁维酵母作为非酿酒酵母，与酿酒酵母相比，对于酯类物质（月桂酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯）、酸类物质（正癸酸）和醛类物质（3,4-二甲基苯甲醛）含量的提高有较为显著的效果，新增的几种高级醇（正辛醇、[R-（R*，R*）]-2,3-丁二醇、2-壬醇）、酯类（乙酸辛酯、9-十六碳烯酸乙酯）及酮类物质（2-壬酮、2-庚酮），丰富了样品中的香气物质种类。

综上所述，以柿子为原料，利用马克斯克鲁维酵母进行发酵，与酿酒酵母相比，可以产生更多的天然芳香化合物，使得柿子酒、柿子醋中的香气成分更加丰富和浓郁，从而起到提高柿子酒、柿子醋香气品质的作用。