杜仲苷对骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制

任 虹，刘 娟，于桂泳，李 美

0 引 言

骨关节炎是中老年人中常见的骨关节性疾病，主要是由关节软骨磨损遭到破坏产生的，软骨细胞凋亡是其重要的病理因素[1]。现有治疗方式有针灸、按摩、推拿、运动等非药物治疗；镇痛剂、维生素C、糖皮质激素及软骨保护剂等药物治疗；截骨术、关节融合等外科手术治疗[2]。而中医药治疗骨关节炎是一种更有效、成本更低、创伤更小的治疗方法[3]。杜仲因其有抗炎和抗骨质疏松等疗效而常被用来治疗骨伤科疾病，是一种重要的中药材。杜仲苷是杜仲的主要成分， 研究发现杜仲苷可以提高体外炎性环境下大鼠软骨细胞的增殖活力[4]。王胜楠等[5]研究发现杜仲苷能抑制IL-1β诱导的大鼠软骨细胞炎症、分解代谢、细胞凋亡及相关蛋白的表达。然而杜仲苷影响软骨细胞增殖和凋亡的分子机制尚未完全清楚。因此，本研究旨在研究杜仲苷对人骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂胎牛血清、DEME培养基(美国Gibco公司)；RNA提取试剂盒、qPCR试剂盒(日本Takara公司)；细胞计数试剂盒-8、蛋白提取试剂盒、凋亡检测试剂盒(碧云天)。杜仲苷(HPLC≥98%，成都普菲德生物技术有限公司)。5810R离心机(德国Eppendrof公司)；Multiskan FC酶标仪(美国Thermo公司)；FACS caliber流式细胞仪、PowerPac蛋白电泳仪及Gel Doc XR+凝胶显示系统(美国BD公司)；LightCycler480 荧光定量PCR仪(美国Roche公司)。

1.2方法

1.2.1 人骨关节炎软骨细胞的分离培养骨关节炎软骨组织由当地骨科医院提供，具体操作方法参考文献 [5]，无菌条件下切碎软骨组织，0.15%的胶原酶充分消化，过22目细胞，400 g/min离心10 min，离心半径10 cm，去上清。加入DEME培养液重悬，在37 ℃下培养。

1.2.2细胞分组和转染取对数生长期软骨细胞，分别用终浓度为10、100、500、1000 μmol/L的杜仲苷处理，分别为杜仲苷10 μmol/L组、杜仲苷100 μmol/L组、杜仲苷500 μmol/L组、杜仲苷1000 μmol/L组，对照组为正常培养的细胞。

取对数生长期软骨细胞，无血清重悬后进行转染，分为pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-Prdx5组(转染pcDNA-Prdx5 mimics)、杜仲苷+si-NC组(转染si-NC后用500 μmol/L杜仲苷处理)、杜仲苷+si-Prdx5组(转染si-Prdx5后用500 μmol/L杜仲苷处理)。

1.2.3qRT-PCR分析Bcl-2、Bax、Prdx5 mRNA表达水平提取总RNA，逆转录成cDNA，反应条件：30℃ 10 min，42℃ 1 h，70℃ 15 min，终止反应，冰上冷却。按荧光定量PCR试剂盒说明操作，配置反应体系，总反应体系20 μL(ddH2O 8 μL、上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，2×SYBR premix Ex-tap 10 μL)，然后进行PCR，反应程序：95℃预变性2 min，95℃ 10 s、60℃ 50 s，共40个循环，反应结束后进行熔解曲线分析，以β-actin为内参基因，相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.2.4Westernblot检测蛋白表达提取各组细胞总蛋白，进行SDS-PAGE后，转膜后进行封闭，加入一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗室温孵育2 h，显影，分析蛋白条带灰度值，以β-actin为参照计算蛋白表达水平。

1.2.5CCK-8法测定骨关节炎软骨细胞增殖取各组对数生长期细胞，培养48 h后，加入10 μL CCK-8溶液，反应2 h后用酶标仪检测490 nm处A值，以A值指代细胞活性。

1.2.6流式细胞术检测细胞凋亡收集各组细胞，漂洗后重悬细胞，加入500 μL的结合缓冲液混匀，然后加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混匀后避光孵育10 min；上流式细胞仪检测。

2 结 果

2.1 不同浓度杜仲苷对骨关节炎软骨细胞增殖的影响与对照组比较，随着杜仲苷浓度的升高，骨关节炎软骨细胞的活性逐渐升高(P<0.05)。表明杜仲苷可促进骨关节炎软骨细胞增殖。但杜仲苷500 μmol/L组和杜仲苷1000 μmol/L组对骨关节炎软骨细胞活性的影响差异无统计学意义(P>0.05)，故选用浓度500 μmol/L杜仲苷(杜仲苷组)用作后续实验。见图1。

与对照组比较，*P<0.05；与杜仲苷10 μmol/L组比较，#P<0.05；与杜仲苷100 μmol/L组比较，△P< 0.05

2.2杜仲苷对骨关节炎软骨细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示，杜仲苷组骨关节炎软骨细胞的凋亡率[(7.89±1.03)%]较对照组[(18.76±1.24)%]显著降低(P<0.05)。表明杜仲苷可明显抑制骨关节炎软骨细胞凋亡。见图2。

图 2 杜仲苷对骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

2.3杜仲苷对骨关节炎软骨细胞凋亡相关基因表达的影响qRT-PCR和Western blot检测结果显示，与对照组比较，杜仲苷组Bcl-2 mRNA和蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)，Bax mRNA和蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)。表明杜仲苷可促进Bcl-2的表达，抑制Bax的表达。见图3，表1。

图 3 杜仲苷对骨关节炎软骨细胞凋亡相关蛋白表达的影响

表 1 杜仲苷对骨关节炎软骨细胞凋亡相关基因表达的影响

2.4杜仲苷对骨关节炎软骨细胞Prdx5表达的影响qRT-PCR和Western blot检测结果显示，与对照组比较，杜仲苷组Prdx5 mRNA和蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。表明杜仲苷促进Prdx5 mRNA和蛋白的表达。见图4，表2。

图 4 杜仲苷对骨关节炎软骨细胞Prdx5蛋白表达的影响

表 2 杜仲苷对骨关节炎软骨细胞Prdx5表达的影响

2.5Prdx5过表达对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡的影响Western blot检测结果显示，pcDNA-Prdx5组Prdx5蛋白的表达水平显著高于pcDNA组(P<0.05)。CCK-8法检测结果显示，pcDNA-Prdx5组骨关节炎软骨细胞的活性显著高于pcDNA组(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示，pcDNA-Prdx5组骨关节炎软骨细胞的凋亡率显著低于pcDNA组(P<0.05)。可见，Prdx5过表达能促进骨关节炎软骨细胞增殖，抑制其凋亡。见图5、图6，表3。

图 5 Western blot检测 Prdx5蛋白的表达

图 6 细胞凋亡流式检测Prdx5过表达对骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

表 3 Prdx5过表达对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡的影响

2.6Prdx5抑制表达逆转了杜仲苷对骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡的作用Western blot检测结果显示，与对照组Prdx5蛋白的表达水平比较，杜仲苷组显著升高(P<0.05)；与杜仲苷+si-NC组Prdx5蛋白的表达水平比较，杜仲苷+si-Prdx5组显著降低(P<0.05)。CCK-8法检测结果显示，与对照组骨关节炎软骨细胞的活性比较，杜仲苷组显著升高(P<0.05)；与杜仲苷+si-NC组骨关节炎软骨细胞的活性比较，杜仲苷+si-Prdx5组显著降低(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示，与对照组骨关节炎软骨细胞的凋亡率比较，杜仲苷组显著降低(P<0.05)；与杜仲苷+si-NC组骨关节炎软骨细胞的凋亡率比较，杜仲苷+si-Prdx5组显著升高(P< 0.05)。表明Prdx5抑制表达逆转了杜仲苷对骨关节炎软骨细胞增殖促进和凋亡抑制的作用。见图7、图8，表4。

1:对照组； 2:杜仲苷组； 3:杜仲苷+si-NC组; 4:杜仲苷+si-Prdx5组

a:对照组； b:杜仲苷组； c:杜仲苷+si-NC组; d:杜仲苷+si-Prdx5组

表 4 Prdx5抑制表达逆转了杜仲苷对骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡的作用

3 讨 论

骨关节炎病症持续时间长，严重威胁着人类的健康和生活质量[6-7]。寻求一种能够较为彻底改善治疗骨关节炎病的方式显得尤为重要。近些年来关于中药在关节炎上的应用已有很多，杜仲是使用频率较高的一种[8]。临床上杜仲多用来治疗高血压、腰痛、关节炎等疾病[9]。王和鸣等[10]研究发现复方杜仲健骨颗粒能有效改善膝骨关节症状，用药安全，无毒副作用。向开兴等[11]发现杜仲灵仙汤对骨性关节炎的治疗有较好的临床效果。鲁海等[12]研究发现杜仲可调节大鼠骨性关节炎中MMPs和TIMPs的表达，能保护关节软骨。崔永锋等[13]研究发现内服杜仲水煎液有利于兔子创伤性骨折的愈合。杜仲还能抑制蛋清所致大鼠的足肿胀，减轻小鼠的炎症，有抗炎作用[14]。

Peroxiredoxins(Prdxs)是一类保护细胞，抵抗氧化，调节细胞内信号传导和细胞增殖的蛋白[15]。Prdx蛋白在清除细胞内的活性氧预防肿瘤同时又能清除肿瘤细胞中的活性氧而保护肿瘤[16]。Prdx5(Peroxiredoxin V)是过氧化物还原酶家族的成员之一，具有抗氧化作用，可作为乳腺癌的标记基因[15]。Prdx5在人软骨中组成型表达，在骨关节炎软骨中上调表达[17]。研究发现Prdx5可以瞬时抑制ISG54介导的细胞凋亡[18]。Prdx5在骨关节炎软骨组织中高表达，抑制Prdx5表达能通过上调Wnt/β-catenin信号通路而抑制骨关节炎软骨细胞的增殖、促进其凋亡[19]。Prdx4过表达增加了ROS的产生，降低了Bcl-2，p-AKT的表达水平从而显著降低IL-1β诱导的软骨细胞凋亡[20]。Prdx5对骨关节炎的预防和治疗具有重要价值。

杜仲对过氧化物酶有一定的影响，如杜仲雄花茶能提高小鼠中的SOD和GSH-Px等过氧化物酶的活性，有一定的抗氧化、抗衰老作用[21]。以杜仲作为主要成分之一的草药可提高部分致癌物代谢酶的活性，抑制肝癌的发生[22]。此外，还可以通过一些信号传导途径来实现其功能。杜仲苷通过抑制NF-κB活化途径抑制TNF-α诱导的炎症[23]。杜仲苷别名桃叶珊瑚苷，桃叶珊瑚苷可以通过清除ROS，下调Bax表达，上调Bcl-2表达来抑制细胞凋亡、保护受损的HaCaT细胞[24]；桃叶珊瑚苷通过ROS/P38通路抑制HSF细胞凋亡[25]。

本研究发现，杜仲苷可以提高骨关节炎软骨细胞的活性，抑制细胞凋亡，提高Prdx5的表达水平。Prdx5过表达可以提高骨关节炎软骨细胞的活性，抑制细胞凋亡。Prdx5抑制表达逆转了杜仲苷对骨关节炎软骨细胞的增殖促进和凋亡抑制作用。综上所述，杜仲苷可以促进骨关节炎软骨细胞增殖，抑制其凋亡，其机制可能与Prdx5有关。