冷藏充二氧化碳对切花菊的影响

章康艺，余 莎，楼恬恬，邬雨津，寿建昕，俞明操

（1.绍兴文理学院生命科学学院，浙江绍兴 312000；2.浙江丰岛股份有限公司，浙江新昌 312500）

菊花（Dendranthemuma morifolium）是我国十大传统名花和世界四大切花之一，在花卉生产、园林绿化和美化环境中占有十分重要的地位。我国是栽培菊花的起源中心和菊属种质资源的分布中心，菊属有40 余种，在我国分布的就有20 余种，栽培品种达3 000 余个[1]。鲜切花生产是花卉产业中附加值最高的一个分支，正以前所未有的速度蓬勃发展。中国是世界鲜切花的最大生产国，鲜切花产销量占全球切花总量的30%以上。我国菊花的产量和规模正在逐年扩大，产销量占全球鲜切菊花总量的18%以上，在国内鲜切花中，菊花约占总产量的30%。切花采后的数量损失，发达国家为5%～25%，发展中国家为20%～50%[4]。世界发达国家的切花生产商都通过栽培及采后保鲜控制技术，满足消费者对切花观赏性和延长瓶插寿命的要求，但同国外相比，由于对菊花的采收前和采后生理研究不够，保鲜技术水平仍有较大差距，导致我国菊花切花在采后和流通中的损失高达20%左右[5]，造成资源浪费、环境污染和经济损失。切花菊采摘后，合成物质减少，分解加速，逐渐失水萎蔫走向衰老，并且伴随着复杂的生理生化变化。通过切花采摘并包装后充入不同体积的二氧化碳，对切花菊水分、代谢相关酶和产物等生物学特征进行研究，并且测试保存后切花菊的瓶插时间，以期为切花菊采后存储运输条件提供参考。

1 材料与方法

1.1 二氧化碳充气保存法

在4℃下向长40～50 cm、PVC 高阻隔材料制成的包装袋中，充入2 个大气压的二氧化碳若干体积，每个包装袋中放入10 支鲜切花，为了和生产方便程度对应，项目组采用计时充气法，设定0 min 为对照，实验组采用0.5、2.0、5.0 min。

1.2 叶相对含水量测定

取新鲜叶片称重W1，放入烘箱内杀青0.5 h 后80℃烘至恒重，称重W2。相对含水量计算公式：相对含水量=[（W1-W2）/W1]×100%，每测定重复3 次。

1.3 可溶性糖含量的测定

采用蒽酮比色法。取叶片擦净表面污物，剪碎混合，称取0.25 g，共3 份，分别放入3 支刻度试管中，加入5 mL蒸馏水，薄膜封口，于沸水中提取30 min（提取2 次），提取液过滤入25 mL 容量瓶中，用蒸馏水反复漂洗试管及残渣并定容至25 mL。吸取样品提取液0.5 mL 于20 mL刻度试管中，加蒸馏水1.5 mL，然后按顺序向试管中加入0.5 mL 2%的蒽酮乙酸乙酯和5 mL 浓硫酸，放入沸水中保温1 min，自然冷却至室温，以不加提取液的空白作对照，在630 nm 波长下测其吸光度。以蔗糖做标准曲线。

1.4 可溶性蛋白含量的测定

采用考马斯亮蓝G-250 染色法，稍有改动。称切花菊叶片0.5 g，用5 mL 蒸馏水研磨成匀浆后，3 000 r/min 离心10 min，取上清液0.1 mL 放入具塞试管中，并加入蒸馏水0.9 mL，再加入5 mL 考马斯亮蓝G-250 溶液，充分混合，放置2 min 后在595 nm 下比色，测定吸光度，并通过以牛血清蛋白所作标准曲线求值。

V样品中蛋白质的含量=[C×VT/VS×WF×1 000]（mg/g）

式中：C 为查标准曲线值（μg）；VT为提取液总体积（mL）；VS为测定时的加样量（mL）；WF为样品鲜重（g）。

1.5 过氧化物酶活性测定

取10 mL 50 mmol/L（pH 7.8）的磷酸缓冲液于反应管中，加入0.076 mL 0.3%液体愈创木酚，0.112 mL 30%的H2O2，0.1 mL 叶片粗酶液，立即摇匀，然后测定470 mn 处的吸光值，3 min 内每隔30 s 记录1 次，共计6 次。以1 min内A470 变化0.01 为一个酶活性单位（U）。

1.6 超氧化物歧化酶活性测定

SOD 反应体系为3 mL：50 mmol/L 的磷酸缓冲液（PBS）（pH 7.8）1.7 mL，130 mmol/L 甲硫氨酸溶液0.3 mL，750 μmol/L氮蓝四唑溶液0.3 mL，l mmol/L EDTA-Na2溶液0.3 mL，20 μmol/L 核黄素溶液0.3 mL，酶液0.1 mL。同时做2 支对照管，取3 mL 反应混合液加入0.1 mL PBS，其中一支管照光后，作为光最大还原管，另一支置于黑暗中，测定时用于调零。各管置于270 μmol/m2·s 日光灯25℃下照光反应20 min，反应结束后，分别测定各管在560 nm 处的吸光值。

1.7 丙二醛（MDA）含量测定

称取切花叶0.5 g，加入5 ml 5%的三氯乙酸（TCA），充分研磨，将匀浆转入10 mL 的离心管中，在转速3 000 r/min下离心10 min，取上清液2 mL（上清液为样品提取液），加入2 mL 0.67%硫代巴比妥酸（TBA），在100℃沸水浴中煮沸30 min，冷却（冰浴）后再离心1 次，分别测定上清液在450、532、600 nm 波长下的吸光度，（以2 mL 蒸馏水加2 mL 0.67% TBA 的混合液作为对照测定进行比色）。

MDA 浓度（μmol/L）= 6.45（D532-D600）-0.56D450

MDA 浓度（μmol/g）= MDA 浓度（μmol/L）×提取液体积（5 mL）/植物组织鲜重（g）

1.8 切花瓶插检验

采用自来水瓶插检验，每种存储条件下10 支1 组，重复3 组，观察瓶插衰败情况。

2 结果与分析

2.1 叶相对含水量

对包装后的箱装切花菊分别进行0、0.5、2.0、5.0 min的二氧化碳充气，保存至4℃培养箱中，隔天取样测定，保存14 d。从图1 可以看出，前4 d 4 个保存组相对含水量无显著性差异，第6 天充入0.5 min 的组相对含水量开始上升，显著高于其他组别，充入5 min 组相对含水量开始显著减少于其他组别。由于保存至第10 天，充入5.0 min的实验组出现比较严重的腐烂，导致该组后续数据无法测得，3 个平行组均出现此现象，说明大量充入二氧化碳，切花菊进入了无氧呼吸，产生了大量的乙醇，切花菊正常的采后生理被破坏。但充入0.5 min 的组直至14 d，相对含水量都要多于对照组，说明少量充入二氧化碳，对切花菊保持活性是有利的。

2.2 可溶性糖含量

将采后的切花菊按上述方法装箱后，进行0、0.5、2.0、5.0 min 的二氧化碳充气，保存至4℃培养箱中，隔天取样测定其可溶性糖的含量，分析在4℃下，充不同量二氧化碳对保存切花菊可溶性糖的影响。从图2 可以看出，第4天0、0.5、2.0 min 3 个保存组间切花菊可溶性糖含量无显著性差异，但充5.0 min 组可溶性糖含量显著高于其他3组。但5.0 min 组在4 d 后可溶性糖含量出现急剧降低，第8 天降至25 mg/g。由于保存至第10 天，充入5.0 min 的实验组出现比较严重的腐烂，导致该组后续数据无法测得，3 个平行组均出现此现象，说明大量充入二氧化碳，切花菊进入了无氧呼吸，产生了大量的乙醇，切花菊正常的采后生理被破坏。0.5 min 和2.0 min 组第6 天可溶性糖含量接近，均显著高于对照，其后至试验结束，充入0.5 min 二氧化碳组可溶性糖含量均显著高于2.0 min 组及对照，这可能是由于装箱后，切花菊转入了暗反应阶段，充入低剂量二氧化碳有助于其糖类等有机物的合成。

图2 4℃下充二氧化碳对切花菊可溶性糖含量的影响

2.3 可溶性蛋白（SP）含量

将采后的切花菊按上述方法装箱后，进行0、0.5、2.0、5.0 min 的二氧化碳充气，保存至4℃培养箱中，隔天取样测定其可溶性蛋白含量，分析在4℃下，充不同量二氧化碳对保存切花菊可溶性蛋白的影响。从图3 可以看出，充入二氧化碳后4 个组别中可溶性蛋白均呈下降趋势，但各组别间无显著性差异，但由于保存至第10 天，充入5.0 min的实验组出现比较严重的腐烂，导致该组后续数据无法测得，3 个平行组均出现此现象，说明大量充入二氧化碳，切花菊进入了无氧呼吸，产生了大量的乙醇，切花菊正常的采后生理被破坏。说明在4℃下保存切花菊，二氧化碳的浓度对可溶性蛋白的影响不太大。

图3 4℃下充二氧化碳对切花菊可溶性蛋白含量的影响

2.4 过氧化物酶（POD）活性

采后的切花菊按上述方法装箱后，进行0、0.5、2.0、5.0 min 的二氧化碳充气，保存至4℃培养箱中，隔天取样测定其过氧化物酶活性，分析在4℃下，充不同量二氧化碳对保存切花菊过氧化物酶活性的影响。从图4 可以看出，4 个组别的切花菊中过氧化物酶活性在前4 d 均出现上升趋势，其中5.0 min 组的上升最为明显，极显著高于其他3 组，达到143.94 U/mg·FW，其后5.0 min 组过氧化物酶活性出现下降直至测定第8 天，由于保存至第10 天，充入5.0 min 的实验组出现比较严重的腐烂，导致该组后续数据无法测得。对照组在第6 天后出现逐渐下降趋势。0.5 min 组第10 天出现上升，至170.76 U/mg·FW，其后出现降低，但过氧化物酶活性0.5 min 组极显著高于其他组别。

图4 4℃下充二氧化碳对切花菊过氧化物酶活性的影响

2.5 超氧化物歧化酶（SOD）活性

将采后的切花菊按上述方法装箱后，进行0、0.5、2.0、5.0 min 的二氧化碳充气，保存至4℃培养箱中，隔天取样测定其超氧化物歧化酶活性，分析在4℃下，充不同量二氧化碳对保存切花菊超氧化物歧化酶活性的影响。从图5可以看出，前6 d 4 个组别超氧化物歧化酶活性均上升，其中5.0 min 组第6 天后出现迅速下降，由于保存至第10天，充入5.0 min 的实验组出现比较严重的腐烂，导致该组后续数据无法测得。对照组和2.0 min 组第10 天后出现下降，但是2.0 min 组的SOD 酶活性高于对照组，0.5 min组除第14 天出现下降外，其他测试值均较前次增加，第12天出现最高值，达35.02 U/mg·FW。

图5 4℃下充二氧化碳对切花菊超氧化物歧化酶活性的影响

2.6 丙二醛（MDA）含量

将采后的切花菊按上述方法装箱后，进行0、0.5、2.0、5.0 min 的二氧化碳充气，保存至4℃培养箱中，隔天取样测定其丙二醛的含量，分析在4℃下，充不同量二氧化碳对保存切花菊丙二醛含量的影响。从图6 可以看出，4 个组别的丙二醛含量均出现持续上升，其中2.0 min 组在第10 天后出现快速增加，极显著高于其他组别，到第14 天达到28.72 mol/g·FW。

图6 4℃下充二氧化碳对切花菊丙二醛含量的影响

2.7 切花菊瓶插最大花径和瓶插寿命

将经过14 d 保存后的切花菊包装打开进行纯水瓶插试验，测定切花菊瓶插后的最大花径和瓶插寿命。从表1可以看出，由于5.0 min 组在实验第10 天出现腐烂，故不能继续瓶插检验，其他3 组纯水瓶插后的试验结果表明：充二氧化碳0.5 min 与对照组在花径大小上无显著性差异，但是极显著高于2.0 min 组，花平均寿命0.5 min 组最长，达到16.49 d，极显著高于对照组，2.0 min 组极显著低于对照组，说明充入低剂量二氧化碳有利于瓶插时间的延长。叶的寿命对照组与0.5 min 组无显著差异，2.0 min组极显著低于对照。

表1 切花菊瓶插最大花径和瓶插寿命

3 结论

切花菊采摘后，合成物质减少、分解加速，逐渐失水萎蔫走向衰老，并且伴随着复杂的生理生化变化。项目组利用切花菊包装后充入不同体积的二氧化碳，测定与切花菊衰老相关的指标，来确定包装切花菊的最适二氧化碳充入量。经过测定后发现在4℃保存温度下，充入低剂量的二氧化碳，有利于切花菊的瓶插延时，但随着二氧化碳浓度增加，包装中相对氧含量降低，导致切花菊开始进行无氧呼吸，对其生理活动影响很大，当项目组在包装中充入5.0 min 二氧化碳后，出现腐烂现象。综上，切花菊采后包装完成后，应尽快移至4℃冷库冷藏，并且充入低剂量二氧化碳，能够延长瓶插时间。