知黄溃疡合剂对复发性口腔黏膜溃疡大鼠创面修复的作用及对MCP-1/CCR2/NF-κB通路的影响*

耿乾书，姚 娜，王 雯，李庆隆

（唐山市协和医院，河北 唐山 063000）

复发性口腔黏膜溃疡为口腔科最常见的口腔黏膜疾病，发生率位居口腔黏膜病首位，主要表现为口腔黏膜反复出现孤立椭圆形或者圆形浅表溃疡，可单发或多发于口腔黏膜任意位置，有复发性、周期性特征[1-2]。当前，西医对复发性口腔黏膜溃疡的治疗方法虽多，但无特效疗法[3]。中医对复发性口腔黏膜溃疡早有认知，认为外感六淫燥火、内伤脏腑热盛为其主要致病因素，提出了诸多治疗方剂，其中知黄溃疡合剂疗效显著[4]，但其对复发性口腔黏膜溃疡创面的修复机制尚不清楚。故本研究制备了复发性口腔黏膜溃疡大鼠模型，研究知黄溃疡合剂的具体作用及机制，以期为临床应用提供理论基础与实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 7周龄SPF级雄性健康SD大鼠70只，体质量260～280 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2019-0010。分笼饲养，自由摄食、饮水，室温24～26 ℃，相对湿度40%～60%，12 h明暗交替照明，实验开展前适应性饲养1周。本研究已经医学实验动物管理委员会批准，批准号：20200115。

1.2 药物与试剂 弗氏完全佐剂（上海雷浩信息科技有限公司，货号：F5881）；左旋咪唑水溶液（山东博山制药有限公司，批号：170325）；知黄溃疡合剂（四川省南充市中心医院，批号：170323）；大鼠γ干扰素（interferon gamma，IFN-γ）ELISA试剂盒（批号：20190411）、白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）ELISA试剂盒（批号：20190406）均购自上海江莱生物科技有限公司；大鼠T淋巴细胞亚群试剂盒（北京科瑞美科技有限公司，批号：20190412）；APC-CD3抗体（批号：20190621）、PE-CD4抗体（批号：20910814）、FITC-CD8抗体（批号：20190119）均购自上海研生实业有限公司；10%溶血素（美国Beckman Coulter公司，批号：20180115）；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）（中国碧云天生物技术有限公司，批号：20190519）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒（批号：20190811）、细胞裂解液（批号：20181214）均购自中国碧云天生物公司；兔抗大鼠β-actin（批号：20190517）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）（批号：20190305）、趋化因子受体-2（2CC-Chemokine Receptor 2，CCR2）（批号：20190905）、核因子-κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）（批号：20190817）、磷酸化型NF-κB p65（p-NF-κB p65）多克隆抗体（一抗）（批号：20190929）均购自西宝生物科技股份有限公司；辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）标记山羊抗兔IgG二抗（北京百奥莱博科技有限公司，批号：20190425）。

1.3 主要仪器 FSH-2可调高速匀浆机（常州市金坛区环宇科学仪器厂）；5415D型离心机（广州和竺生物科技有限公司）；Leica RM2235超薄石蜡切片机（德国徕卡微系统有限公司）；EPICS-reg ALTRA型流式细胞仪（山东博科干细胞应用研究院有限公司）。

1.4 造模与分组 70只大鼠随机选取15只用于制作复发性口腔黏膜溃疡抗原，具体操作：脱颈处死大鼠，无菌操作剥离大鼠口腔黏膜，生理盐水冲洗，加入10倍量的生理盐水，采用高速匀浆机2 000 r/min匀浆20 min，制好的黏膜匀浆置于-20 ℃保存。将等量的弗氏完全佐剂和黏膜匀浆混匀，期间顺时针方向逐滴加入研磨，研磨至乳剂。其余55只大鼠随机选取10只作为对照组，剩余45只采用免疫法制备复发性口腔黏膜溃疡大鼠模型[5]，常规消毒45只造模大鼠脊柱两侧，皮内注射上述乳剂，每只注射2点，每点0.1 mL，每周注射1次，连续注射8周。大鼠口腔黏膜多处肿胀，下齿龈有充血、红肿、溃疡创面，即为造模成功。将造模成功的40只大鼠随机分为模型组、左旋咪唑组、知黄溃疡合剂低剂量组、知黄溃疡合剂高剂量组，每组10只。

1.5 实验给药 造模成功24 h后开始给药，大鼠的等效剂量为成人剂量6.3倍，故左旋咪唑组大鼠予以2 mL左旋咪唑水溶液灌胃，20 mg/kg；知黄溃疡合剂低、高剂量组大鼠分别予以2 mL知黄溃疡合剂灌胃，原生药剂量分别为4、8 g/kg；模型组、对照组大鼠予等体积生理盐水灌胃。1次/d，连续给药20 d。

1.6 观察指标

1.6.1 大鼠口腔溃疡变化 观察各组大鼠造模后口腔溃疡数目、干预后溃疡愈合程度，其中口腔黏膜溃疡组织学分级标准见表1，计算各组大鼠口腔溃疡数目平均值、溃疡愈合评分平均值。

1.6.2 大鼠血清炎症因子 末次干预后，大鼠禁食不禁水16 h，2%戊巴比妥钠麻醉后，脱颈处死，在腹主动脉取血5 mL置入试管内，室温下静置30 min，离心机3 000 r/min离心10 min，离心半径10 cm，分离血清。按ELISA试剂盒说明书检测血清IFN-γ、IL-17含量，在波长450 nm酶标仪上读取各孔光密度值，以光密度值为纵坐标，标准品浓度作为横坐标，绘制曲线图，根据样品光密度值计算浓度范围。

1.6.3 大鼠外周血T淋巴细胞亚群 取大鼠外周血100 μL置入流式管底，再各取20 μL APC-CD3抗体、PE-CD4抗体、FITC-CD8抗体置入流式管底，与全血混匀，室温避光孵育20min。每管加1倍溶血素2 mL，混匀后避光静置10 min，1 000 r/min离心5 min，半径10 cm，弃上清，加2 mL PBS洗液重悬细胞，采用流式细胞仪检测CD4+、CD8+及CD4+/CD8+。

1.6.4 大鼠口腔黏膜组织病理变化 大鼠以2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，切取对照组大鼠口腔黏膜组织、造模大鼠口腔黏膜溃疡组织，体积为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，生理盐水冲洗组织块上黏液、血液，展平后维持原型。4%中性甲醛固定，梯度脱水、浸蜡、包埋，最后切片，厚度为4 μm，常规HE染色，光学显微镜下观察。

1.6.5 大鼠口腔黏膜组织MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65蛋白表达 按试剂盒说明书提取大鼠口腔黏膜组织蛋白，BCA法测定蛋白总量，蛋白与上样缓冲液混匀后，沸水浴10 min使之变性，冷却后离心取上清，取60 μg进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳分离，电转仪电转60 min，封闭液室温孵育2 h，加入1∶1 000稀释的兔抗大鼠β-actin、MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65抗体（一抗），4 ℃摇床过夜，加入1∶10 000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，常温孵育30 min，暗室中曝光、显影，用凝胶成像系统检测目的条带，MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65灰度值与内参β-actin灰度值比值，即为目的蛋白相对表达量，并计算p-NF-κB p65/NF-κB比值。

1.7 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件分析数据，计量资料以“均数±标准差”（）表示，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，如Levene检验方差齐，采用单因素方差分析，再用LSD-t行两两比较，如Levene检验方差不齐，改用welch检验，再用Dunnett T3检验进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠口腔溃疡变化比较 5组大鼠口腔溃疡数目、溃疡评分比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，左旋咪唑组、黄溃疡合剂低剂量组、知柏溃疡合剂高剂量组大鼠溃疡数目减少，溃疡评分降低（P＜0.05）；与左旋咪唑组比较，知黄溃疡合剂低、高剂量组大鼠溃疡数目增多，溃疡评分升高（P＜0.05）；与知黄溃疡合剂低剂量组比较，知黄溃疡合剂高剂量组溃疡数目减少，溃疡评分降低（P＜0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠口腔溃疡数目、溃疡评分比较（）

表2 各组大鼠口腔溃疡数目、溃疡评分比较（）

注：与模型组比较，aP＜0.05；与左旋咪唑组比较，bP＜0.05；与知黄溃疡合剂低剂量组比较，cP＜0.05

2.2 各组大鼠血清炎症因子水平比较 5组大鼠血清IFN-γ和IL-17含量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，模型组、左旋咪唑组、知黄溃疡合剂低剂量组、知黄溃疡合剂高剂量组大鼠血清IFN-γ和IL-17含量升高（P＜0.05）；与模型组比较，左旋咪唑组、知黄溃疡合剂低剂量组、知黄溃疡合剂高剂量组大鼠血清IFN-γ和IL-17含量降低（P＜0.05）；与左旋咪唑组比较，知黄溃疡合剂低剂量组、知黄溃疡合剂高剂量组大鼠血清IFN-γ和IL-17含量升高（P＜0.05）；与知黄溃疡合剂低剂量组比较，知黄溃疡合剂高剂量组大鼠血清IFN-γ和IL-17含量降低（P＜0.05）。（见表3）

表3 各组大鼠血清炎症因子水平比较（，pg/mL）

表3 各组大鼠血清炎症因子水平比较（，pg/mL）

注：与对照组比较，aP＜0.05；模型组比较，bP＜0.05；与左旋咪唑组比较，cP＜0.05；与知黄溃疡合剂低剂量组比较，dP＜0.05

2.3 大鼠外周血T淋巴细胞亚群比较 5组大鼠外周血CD4+、CD4+/CD8+比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，模型组、左旋咪唑组、知黄溃疡合剂低剂量组、知黄溃疡合剂高剂量组大鼠外周血CD4+、CD4+/CD8+降低，CD8+升高（P＜0.05）；与模型组比较，左旋咪唑组、知黄溃疡合剂低剂量组、知黄溃疡合剂高剂量组大鼠外周血CD4+、CD4+/CD8+升高，CD8+降低（P＜0.05）；与左旋咪唑组比较，知黄溃疡合剂低剂量组、知黄溃疡合剂高剂量组大鼠外周血CD4+、CD4+/CD8+降低，CD8+升高（P＜0.05）；与知黄溃疡合剂低剂量组比较，知黄溃疡合剂高剂量组大鼠外周血CD4+、CD4+/CD8+升高，CD8+降低（P＜0.05）。（见表4、图1）

表4 各组大鼠外周血T 淋巴细胞亚群比较（）

表4 各组大鼠外周血T 淋巴细胞亚群比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；模型组比较，bP＜0.05；与左旋咪唑组比较，cP＜0.05；与知黄溃疡合剂低剂量组比较，dP＜0.05

图1 各组大鼠外周血T 淋巴细胞亚群流式图

2.4 各组大鼠口腔黏膜组织病理变化 对照组大鼠黏膜上皮完整，无炎症细胞浸润；模型组大鼠口腔黏膜组织破溃，细胞核深染、固缩、碎裂，可见大量空泡变性，大量炎症细胞浸润；左旋咪唑组、知黄溃疡合剂高剂量组大鼠口腔黏膜上皮组织基本完整，炎症细胞浸润较少；知黄溃疡合剂低剂量组大鼠炎症细胞浸润情况较模型组有所改善，空泡变性减少。（见图2）

图2 各组大鼠口腔黏膜组织病理图（HE，×200）

2.5 各组大鼠口腔黏膜组织MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65蛋白表达比较 5组大鼠口腔黏膜组织中MCP-1、CCR2蛋白相对表达量及p-NF-κB p65/NF-κB比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，模型组、左旋咪唑组、知黄溃疡合剂低剂量组、知黄溃疡合剂高剂量组大鼠口腔黏膜中MCP-1、CCR2蛋白相对表达量及p-NF-κB p65/NF-κB均升高（P＜0.05）；与模型组比较，左旋咪唑组、知黄溃疡合剂低剂量组、知黄溃疡合剂高剂量组大鼠口腔黏膜中MCP-1、CCR2蛋白相对表达量及p-NF-κB p65/NF-κB均降低（P＜0.05）；与左旋咪唑组比较，知黄溃疡合剂低剂量组、知黄溃疡合剂高剂量组大鼠口腔黏膜中MCP-1、CCR2蛋白相对表达量及p-NF-κB p65/NF-κB均升高（P＜0.05）；与知黄溃疡合剂低剂量组比较，知黄溃疡合剂高剂量组MCP-1、CCR2蛋白相对表达量及p-NF-κB p65/NF-κB均降低（P＜0.05）。（见表5、图3）

图3 各组大鼠口腔黏膜组织中MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65 蛋白表达Western blotting 图

表5 各组大鼠口腔黏膜组织中MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65 蛋白表达情况比较（）

表5 各组大鼠口腔黏膜组织中MCP-1、CCR2、NF-κB、p-NF-κB p65 蛋白表达情况比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；模型组比较，bP＜0.05；与左旋咪唑组比较，cP＜0.05；与知黄溃疡合剂低剂量组比较，dP＜0.05

3 讨 论

复发性口腔黏膜溃疡又称“复发性阿弗他溃疡”，病因复杂，包括精神紧张、局部创伤、饮食、维生素缺乏等。目前现代医学认为遗传、免疫、环境因素为其产生发展的重要因素[6]。复发性口腔黏膜溃疡在中医学中属于“口疮”范畴，主要病机为“火”，中医提出了诸多中药方剂，如知黄溃疡合剂，原方源自《辨证录》中的“引火汤”，在辨证论治原则指导下调整，作为常用经验方治疗复发性口腔黏膜溃疡，效果确切，有推广价值[7-8]。

知黄溃疡合剂由熟地黄、黄柏、知母、玄参、麦冬、茯苓、巴戟天组成。熟地黄为君药，滋阴补血；黄柏、知母、麦冬为臣药，黄柏有解毒敛疮、泻火除蒸之功效，专用于湿疹湿疮、疮疡肿毒，知母性寒，可滋阴润燥，麦冬滋养肺金，金水相生，可辅助熟地黄滋阴；茯苓利水渗湿，巴戟天温阳除湿，且水火并补，可“引火归原”。全方共奏温补肾阳、解毒敛疮、滋阴泻火之功效，故适宜用于治疗复发性口腔黏膜溃疡。本研究结果显示，模型组、知黄溃疡合剂低剂量组、知黄溃疡合剂高剂量组大鼠的溃疡数目依次减少，溃疡评分依次降低，提示知黄溃疡合剂有一定治疗作用，其中以高剂量知黄溃疡合剂的效果更佳。复发性口腔黏膜溃疡创面愈合通常需经历炎症、增殖、塑形3个阶段，以炎症为基础，长期炎症反应可造成“难愈性创面”[8]。IL-17、IFN-γ为口腔溃疡产生的主要炎症因子，IL-17是活化T细胞所产生的促炎性细胞因子，IFN-γ含量与溃疡病情密切相关[9-11]。本研究结果显示，与模型组比较，知黄溃疡合剂低剂量组、知黄溃疡合剂高剂量组大鼠血清IFN-γ和IL-17含量降低，其中知黄溃疡合剂高剂量组大鼠血清IFN-γ和IL-17含量更低；HE染色观察大鼠口腔黏膜病理变化发现，知黄溃疡合剂高剂量组大鼠的口腔黏膜上皮组织趋于完整，炎症细胞浸润较少，提示知黄溃疡合剂在复发性口腔黏膜溃疡治疗中有抗炎作用，且高剂量复方溃疡合剂抗炎功效更突出，更有助于保护口腔黏膜组织完整。免疫因素被认为是复发性口腔黏膜溃疡发生的主要因素之一，细胞免疫与其发作存在密切关系。T淋巴细胞分为两类：CD4+T细胞和CD8+T细胞，前者是辅助-诱导亚群，后者是杀伤-抑制亚群，各亚群之间互相调节、平衡，确保机体对外源性抗原刺激产生免疫应答[12-13]。CD4+/CD8+下降可增强机体对各种特异性和非特异性因子的易感性，促进口腔黏膜局部溃疡发生[14]。谢方英等[15]发现复发性口腔黏膜溃疡模型大鼠的CD4+/CD8+明显降低，经治疗后升高，本研究结果与其具有一致性，提示高剂量知黄溃疡合剂在增强复发性口腔黏膜溃疡大鼠自身免疫能力上的积极作用。

梅和平等[16]研究发现复发性口腔黏膜溃疡发作后，巨噬细胞异常激活，分泌大量促炎因子，直接损伤口腔黏膜组织，同时还可激活NF-κB抑制蛋白激酶复合体，促使NF-κB移位到细胞核，并结合靶基因启动区域上NF-κB位点，增强促炎因子IL-17等表达、抑制抗炎因子基因表达，打破抗炎、促炎因子之间平衡，加剧口腔黏膜损伤，反过来再度加速NF-κB扩散及核转移，形成恶性循环，导致口腔黏膜溃疡反复发作、缠绵不愈。MCP-1在复发性口腔黏膜溃疡转归中有重要作用，其可在复发性口腔黏膜溃疡发作时快速结合CCR2，诱导巨噬细胞聚集于口腔、活化，激活炎症信号通路，增加促炎因子分泌，对口腔黏膜组织造成不可逆性损伤。本实验中，模型组大鼠口腔黏膜中MCP-1、CCR2、p-NF-κB p65蛋白表达增强，而知黄溃疡合剂低剂量组、知黄溃疡合剂高剂量组大鼠口腔黏膜中MCP-1、CCR2、p-NF-κB p65蛋白表达明显减弱，其中尤以左旋咪唑组、知黄溃疡合剂高剂量组大鼠蛋白表达最弱，提示高剂量知黄溃疡合剂可能通过下调MCP-1、CCR2、p-NF-κB p65蛋白表达，发挥对复发性口腔黏膜溃疡创面的修复作用。

综上所述，知黄溃疡合剂可有效修复复发性口腔黏膜溃疡模型大鼠创面，发挥抗炎、增强免疫的效应，其作用机制可能是抑制MCP-1/CCR2/NF-κB通路。