基于毛细管电泳和离子迁移率经验公式测定洛伐他汀的绝对淌度和解离常数

罗 芳, 郭泽华, 曹成喜, 樊柳荫, 张 薇*

(1. 上海交通大学生命科学技术学院, 微生物代谢国家重点实验室, 上海 200240; 2. 上海交通大学电子信息与电气工程学院, 上海 200240; 3. 上海交通大学学生创新中心, 上海 200240)

近年来,生物化学工程的迅速发展使得大量化合物成为潜在候选药物,了解这些化合物理化性质的需求也日益增长。这也对如绝对淌度(m0, m2/(V·s))和解离常数(pKa)等理化参数的测定方法提出了更高要求。其中,m0指化合物在离子强度趋于零的条件下的淌度,而pKa是水溶液中具有一定解离度的溶质的极性参数。

洛伐他汀是胆固醇合成通路中重要酶羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)的抑制剂,可减少血胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的含量,预防动脉粥样硬化和冠心病等[1]。洛伐他汀的最大吸收波长λmax为238 nm,可溶于碱性溶液。洛伐他汀包括内酯型和酸型(见图1),而内酯型洛伐他汀的亲脂性较强,口服吸收率低,须在肝脏中水解成酸型后才能发挥药理作用。当环境pH值高于7.7时,内酯型洛伐他汀转化为酸型洛伐他汀[2]。因而有必要对洛伐他汀的重要理化参数进行测定,了解其理化特性,从而为更深入的研究提供基本数据和信息。但是,目前大多数对洛伐他汀药物的研究工作主要聚焦于含量测定、作用机理和功能方面,关于测定洛伐他汀m0和pKa值的研究则较少[1-3]。

图 1 内酯洛伐他汀和酸性洛伐他汀的结构Fig. 1 Structures of lactone lovastatin and acid lovastatin

当前已经有许多关于其他化合物pKa值的测定方法,其中最经典的方法是电位计滴定法和光谱法[4-8]。但这些方法相对来说需要耗费大量样品,并且对于纯度低的化合物测定结果不够准确[9,10]。自20世纪70年代以来,高效液相色谱法(HPLC)也已应用于化合物pKa的测定中[11-15]。Bartolini等[16]使用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定乙酰胺的pKa,但液相色谱方法流动相溶液消耗较多,而且单个样品分析时间至少10 min以上,比较耗时。包括毛细管等速电泳法(ITP)和毛细管区带电泳法(CZE)等在内的毛细管电泳法(CE)也广泛应用于水溶性化合物pKa值的测定中[17-25]。

本研究基于CZE和离子淌度的经验方程[26-28],建立了一种精确测定洛伐他汀m0和pKa的新方法。根据经验方程,可以由测得的实际淌度(mact, m2/(V·s))计算m0,再通过m0进一步计算得到pKa。在方法验证部分,使用该方法测定了巴比妥酸、苯甲酸、苄胺、苯酚、间甲酚等有机酸碱的m0和pKa。对pH值低于6的缓冲体系,加入阳离子表面活性剂,采用反向毛细管电泳技术，测定其pKa值。将测定值和理论参考值进行比较,结果发现二者一致性较高,说明该方法具有较高的可靠性。最后应用该方法测定洛伐他汀的m0和pKa。

1 理论推导

1.1 m0的计算方法

在CZE中,有效淌度的计算方法如下[29]:

(1)

其中,meff和mapp分别表示分析物的有效淌度和表观淌度(m2/(V·s)),mEOF表示其电渗流淌度(m2/(V·s)),Ltot和Leff分别为毛细管的总长度和有效长度(m),V表示所施加的电压(V),tobs是观察到的分析物迁移时间(s),tEOF是电渗流下观察到的中性标记物迁移时间(s)。

对于一价弱酸来说,mact与meff之间的关系为[30]:

meff=mactα

(2)

其中,mact是实际淌度,即在给定的离子强度下完全质子化或去质子化离子的淌度(m2/(V·s))。α是解离度。对于一价酸HA,离解度可定义为:

(3)

式中,CHA是反应开始时一元酸的浓度(mol/L), [HA]、[A-]和[H+]分别是反应达到平衡时溶液中一元酸HA、A-和H+的浓度。当分析物100%电离时,其解离度α趋于1,此时式(2)可写为:

meff=mact

(4)

一价离子m0的经验公式[26-28,30-32]可以写成:

(5)

其中,η为常数,当电荷数z为1时(即一元酸或碱),η为0.503 0;当z大于等于2时,η为0.662 9。I为离子强度,根据以下公式来计算:

(6)

式中,ci和zi代表组分i的浓度(mol/L)和电荷数。将式(4)代入式(5)可得m0为:

(7)

需要注意,等式(5)和(7)仅适用于I≤0.1 mol/L和25 ℃条件下。

综上,当分析物处于完全解离状态时,全部以离子形式存在,溶液中无分析物的分子形态。因此可以根据分析物的pKa理论参考值,选择合适pH值的缓冲液以确保分析物能完全解离。在固定的pH下,可以得到分析物在特定离子强度下的mact,并根据公式(7)计算分析物在不同离子强度下的m0。

1.2 pKa的计算方法

对于一元酸HA来说,解离平衡常数为:

(8)

将式(3)代入式(8),得:

(9)

由式(9)进一步可得:

(10)

根据式(10),如果溶液的pH值比酸性(或碱性)分析物的pKa值大(或小)3,即log (α/(1-α))的值为3时,经计算α为0.999,则分析物处于完全解离状态,此时满足1.1节中m0的测定条件。结合公式(2)和(9),可得:

(11)

由式(11)可知,1/meff与[H+]成正比,可通过计算pH值得到。当离子强度一定时,在不同的pH值下可以得到一系列meff值。以氢离子浓度为自变量(x), 1/meff为因变量(y)，得到一条线性回归直线。该直线的斜率1/(mactKa)。由斜率和公式(5)中计算得到的mact,可以求得分析物的Ka,从而进一步求得其pKa。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

高效毛细管电泳仪(1229型,北京新技术仪器有限公司)；未涂覆熔融石英毛细管(总长50 cm(有效长度为25 cm和40 cm)、内径75 μm,中国河北永年光纤厂)；超纯水系统(德国SG Water公司)用以生产电导率低至0.055 μS/cm的超纯水；pH计(瑞士Mettler Toledo公司)。

氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸三钠、磷酸二氢钠、二甲基亚砜(DMSO)、乙酸、醋酸钠、丙酮、巴比妥酸、苯甲酸、苯酚、间甲酚等试剂均购自上海化学试剂公司;苄胺(纯度>99%)购自美国Fluka公司;十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(纯度>99%)购自中美生物科技有限公司;洛伐他汀片(20 mg/片)购自浙江海正股份有限公司。

2.2 背景电解质溶液的制备

对于m0的测定,制备表1所示的一系列pH值相同而离子强度不同的磷酸盐缓冲液,每种缓冲液均制备5种离子强度(0.01、0.04、0.05、0.09和0.1 mol/L)。

表 1 测定m0所用缓冲液

对于pKa的测定,制备表2所示的一系列离子强度相同(0.05 mol/L)而pH值不同的磷酸盐和醋酸盐缓冲液。所有缓冲液用0.45 μm过滤器过滤并保证在两周内使用。

表 2 测定pKa所用缓冲液

2.3 样品的制备

巴比妥酸、苯甲酸、苄胺、苯酚、间甲酚样品分别以1、30、10、0.8、2 mg/mL溶于纯水中。用相应缓冲液将样品分别稀释至终浓度为0.02、0.06、2、0.08、0.10 mg/mL后进样。洛伐他汀样品以1 mg/mL溶解于75%乙醇中,用对应缓冲液稀释至200 μg/mL后进样。

2.4 毛细管预处理及电泳条件

每次进样前将毛细管依次用1.0 mol/L NaOH、超纯水和1.0 mol/L HCl分别冲洗20、10和20 min,最后用该样品对应的缓冲液冲洗30 min。当缓冲液的pH值等于或低于6.0时(本实验中为乙酸缓冲液),在缓冲体系中加入0.8%(v/v)阳离子表面活性剂CTAB,并用含有CTAB的缓冲液冲洗毛细管10 min,然后进行电泳实验。

实验控制在25 ℃室温下进行,设置分离电压为10～15 kV,并以1.33 kPa的压力从毛细管阳极端(在常规CZE下)或从毛细管阴极端(反向CZE下)注入样品。进样过程持续10 s,根据分析物的性质选择合适的吸收波长(巴比妥酸和间甲酚用214 nm,苯甲酸、苄胺和苯酚用254 nm)。使用二甲基亚砜(214 nm紫外吸收波长)或丙酮(254 nm紫外吸收波长)作为中性标记物来标记电渗流(EOF)。

3 结果与讨论

3.1 不同分析物m0和pKa的测定结果

实验结果根据1.1节和1.2节推导的公式,计算得到不同分析物的m0和pKa实验测定值,同时使用通用软件PeakMaster 5.1计算得到其对应m0和pKa的理论参考值(见表3)。测定值与理论参考值相减得到差值,该差值与理论参考值的比值为标准偏差(SD)。从计算结果可以看出,对于m0和pKa的测定,其SD分别不超过6.0%和6.2%。在pKa的测定中,线性回归方程相关系数(R)的范围为0.940～0.999,表明该线性回归直线拟合度较好。这说明该方法得到的m0和pKa测定值与理论参考值一致度较高,证明该测量方法是可靠的,可以用于分析物m0和pKa的测定。

表 3 m0和pKa的实测值和参考值

3.2 洛伐他汀m0和pKa的测定结果

采用DMSO作为电渗流标记物,利用一系列经验公式测定洛伐他汀的m0,利用得到的洛伐他汀m0值和线性回归直线进一步得到pKa值,分别为-1.70×10-8m2/(V·s)和9.00。

本工作采用一系列不同离子强度的Na2HPO4-NaOH缓冲液(pH 12.00)测定洛伐他汀的m0。由前文可知,当溶液的pH值等于12.00时,比分析物的pKa值大3(pKa=9.00),此时mact几乎等于meff,故式(6)适用于m0的计算。同时,如引言所述,当pH值大于7.7时,内酯型洛伐他汀会转化为酸型洛伐他汀,此时洛伐他汀的pKa应大于7.7。而测得的值为9.00,与假设相符,这说明结果具有较高的可靠性。

4 结论

本工作建立了毛细管电泳测定洛伐他汀的m0和pKa的方法。该方法基于毛细管区带电泳和离子淌度经验公式,且适用于酸性和碱性分析物pKa值的测定。同时,在pH值低于6的缓冲体系中,采用具有缩短迁移时间和检测无法到达阴极分析物的能力的反向毛细管电泳法测定pKa。通过与理论参考值对比可知,本文所建立的方法具有较高可靠度和准确性,这将在药物分析中发挥重要作用。本文所建立的方法简单快速,准确率高,能满足化合物m0和pKa的测定需要,同时也为测定化合物其他理化性质提供了参考依据。