基于形态学和ISSR分子标记的迷你甘薯遗传多样性分析

邓禄军， 吴巧玉， 何天久， 邓仁菊， 王启富， 罗 密

(贵州省农业科学院生物技术研究所， 贵阳 550006)

迷你甘薯是指单个薯块重为50～150 g的薯块，其外形美观，质地细腻，口感粉糯香甜，营养丰富，薯块较小，商品性好，具有较好的市场价值[1]。

近年来，国内外学者对甘薯种质资源进行了大量研究，主要是利用形态学性状对甘薯种质资源进行鉴定分类，如黄萍等[2]对贵州引进品种进行形态聚类分析；宋吉轩等[3-4]对贵州地方品种及紫心甘薯进行形态标记聚类分析；李慧峰等[5]对广西地方甘薯品种进行形态标记分类；何虎翼[6]对广西红薯主要育成品种农艺性状进行形态聚类分析。采用形态学来区分遗传变异和种属之间的差别方法最直接简便，但是形态学研究方法具有一定的局限性，容易受到人为因素和环境因素的影响，难以区分亲缘关系较近的材料，因此需结合其他方法对材料进行亲缘关系分析[7-8]。ISSR分子标记技术具有引物设计容易、操作简单、多态性好、可重复性高等优点，在作物种质资源鉴定、分类及亲缘关系分析等方面有广泛的应用[9]。贺学勤等[10]、李强等[11]利用ISSR分子标记技术分析中国甘薯主要亲本的遗传多样性，明确了其遗传差异，结果表明，中国甘薯主要亲本遗传多样性较丰富, 其中自育亲本与外引亲本之间遗传距离较远；宋吉轩等[12]利用ISSR分子标记技术构建23份紫心甘薯遗传多样性图谱；刘中华等[13]对甘薯野生种与地方品种、引进品种及育成品种进行ISSR遗传分析，结果表明，不同类型和不同来源地的甘薯种质资源间存在较大的遗传差异，以野生种和栽培种间的遗传差异最大；赵路宽等[14]利用TP-M 13-SSR技术构建了99份甘薯登记品种的遗传进化树。尽管分子标记在品种鉴别上发挥重要作用，但目前分子标记仍未能取代形态学性状，将两者结合起来更利于鉴定品种之间的遗传关系。目前国内少见利用形态学及分子标记同时对甘薯亲缘关系进行综合分析，而针对迷你甘薯遗传多样性分析尚未见报道。将形态学研究和ISSR标记研究结合分析更能有效提高作物品种间特异性的鉴定，更能客观、准确地确定种质资源的亲缘关系。 因此本研究同时利用形态学性状和ISSR标记分析对引进的16份迷你甘薯品种进行遗传多样性聚类分析，以期为我国迷你型甘薯种质资源创新和品种选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的迷你甘薯品种(系)由浙江省农科院提供(见表1)，种植于贵州省农科院生物技术研究所种植圃。DNA提取试剂盒、ISSR引物、琼脂糖和40%丙烯酰胺溶液、PCR Master Mix试剂盒购自擎科生物科技有限公司；内标试剂(GeneScan 1200LIZ Size Standard)购自美国应用生物系统有限公司。主要设备仪器：PCR仪(A 300，杭州郎基科学仪器有限公司)、电泳仪(JY 600 C，北京君意东方电泳设备有限公司)、凝胶成像仪(JY 04 S-3 C，北京君意东方电泳设备有限公司)、测序仪(ABI-3730 xl，美国应用生物系统公司)、移液器(Eppendorf ，德国艾本得股份公司)。

表1 迷你甘薯材料名称及来源

1.2 试验方法

1.2.1形态学表型性状调查

2020年5月在贵州省农科院试验基地种植，采用随机区组排列，小区面积3 m2,每个小区扦插20株薯苗，重复3次。 施有机肥1 500 kg·(667 m2)-1，复合肥(N-P-K：15-15-15)20 kg·(667 m2)-1。

每个品种以30株为样本, 按农业行业标准NY/T 2939-2016[15]观察、测量、记载 21项形态学性状，取平均值。编码情况见表2。

表2 甘薯形态标记及编码

1.2.2基因组DNA提取

使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒(通用型)，参照李强等[11]的方法进行甘薯基因组DNA提取。

1.2.3ISSR引物筛选

供试引物参照加拿大哥伦比亚大学公布的第9套ISSR引物序列，由擎科生物科技有限公司合成。通过引物筛选，从20条ISSR引物中筛选出6条多态性好且条带相对较清晰的ISSR引物(见表3)。

表3 引物序列信息

1.2.4PCR扩增

PCR反应体系共20 μL：PCR Master Mix(含DNA Polymerase和dNTPs的反应缓冲液)10.0 μL；ISSR引物 1.0 μL；cDNA模板1.0 μL；ddH2O 8 μL。扩增程序：预变性94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50～55 ℃退火 30 s，72 ℃ 30 s进行35个循环)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。扩增产物在3730测序仪(ABI 3730 xl遗传分析仪)进行毛线管电泳，筛选出多态性较好的位点。

1.2.5数据分析

基于形态学性状调查数据运用DPS 数据处理系统，采用唐起义等[16]欧式距离和类平均法(UPGMA)进行聚类分析。ISSR荧光标记遗传多样性分析参照Evanno等[17]的方法，在GenAlEx version 6.501软件和GenePop version 4.14软件中进行。

2 结果与分析

2.1 迷你甘薯形态学性状编码结果及形态学聚类分析

根据NY/T 2939-2016[15]，不同甘薯品种21个性状指标的测定结果如表4所示。

表4 迷你甘薯形态指标测定结果

利用DPS软件采用欧式距离和类平均法进行聚类分析，16份迷你甘薯材料21项主要性状的聚类分析结果见图1。在欧式距离为8.69处，可分为两大类群，类群Ⅰ包括3个品种，分别是：浙13、浙33、QZ 66；类群Ⅱ可包括其余13个品种。类群Ⅰ被分为2个亚群，第一亚群2个品种，分别为浙13和浙33；第二个亚群只有一个品种，为QZ 66，此组品种顶原叶缘色紫，叶尖锐，叶色绿，叶缘色绿，存在薯肉次色。类群Ⅱ分为2大亚群，第一亚群11个品种，分别为：浙259、S 8、浙20、浙15、浙132、浙255、心玉、心香、红香蕉、浙6025、浙70，此组品种主要表现为顶芽色黄绿，叶尖锐，叶色绿，叶缘色绿，薯皮光滑，皮色紫红，无薯肉次色；第二亚群只有浙75和JS-84两个品种，这类品种顶芽色黄绿，叶尖锐，叶色绿，叶缘色绿，叶柄绿，茎主色绿带少量紫斑，主蔓长短。

图1 迷你甘薯形态标记的聚类分析

2.2 ISSR的多态性分析

通过引物筛选，从20条ISSR引物中筛选出6条多态性好且条带相对较清晰的ISSR引物。利用选出的6对引物对迷你甘薯材料进行扩增，扩增产物经过毛细管电泳检测。试验中6对ISSR引物的扩增带型均清晰稳定，多态性较高且明显，适合用于迷你甘薯ISSR分析。遗传多样性参数结果(表5)表明，观测等位基因(Na)2～5个，平均为3个；有效等位基因数(Ne)1.217 5～4.706 0个，平均为2.351 7个；期望杂合度(He)0.173 5～0.387 8，平均为0.218 6；各位点的香农指数(I)0.311 6～1.562 5，平均为0.634 6。以上结果表明，所选取的引物多态性均较高，有很好的鉴别能力，ISSR标记在参试迷你甘薯材料中可反映较丰富的遗传多样性信息。

表5 6对引物扩增条带

2.3 遗传相似性分析结果

利用6对ISSR引物标记，经NTSYS软件计算16份迷你甘薯的遗传相似性系数，结果见表6。16份材料的遗传相似性系数为：0.3～0.858 1。其中遗传相似性系数最小的为浙259和浙75，说明二者亲缘关系较远，遗传差异相对大；遗传相似性系数最大为心香和QZ 66，说明二者亲缘关系较近，遗传差异相对小。从遗传相似性分析结果可知，16份供试迷你甘薯材料之间存在一定的遗传差异性。

表6 16份迷你甘薯的遗传相似性系数

2.4 聚类分析

利用 NTSYSpc 2.1 软件对16份供试材料进行聚类分析，得到相应的聚类图(见图2)，在遗传距离为 1.05处，16份供试迷你甘薯材料可分为两大类(类群Ⅰ和类群Ⅱ)，在类群Ⅰ中，只有4个迷你甘薯品种，分别是浙15、心香、S 8、QZ 66，说明这4种材料亲缘关系较近，和其他品种亲缘关系较远；其他12个甘薯材料则聚为类群Ⅱ。在遗传距离为0.84处，类群Ⅱ又可分为两个亚类，第一个亚类包括：浙6025、浙70、JS-84、浙255、浙13、浙20、浙259；其中浙6025和浙70，JS-84和浙255，浙20和浙259分别被聚在一起，表现出更紧密的亲缘关系；第二个亚类包括：红香蕉、心玉、浙75、浙33、浙132，红香蕉和心玉，浙33和浙132分别被聚在一起，表现出更亲密的亲缘关系。

图2 基于ISSR标记的16份迷你甘薯聚类分析

3 讨 论

本研究发现，迷你甘薯种质资源的形态聚类结果和ISSR分子标记聚类结果存在一定差异。形态学聚类结果表明，材料浙13、浙33、QZ 66聚为一大类，说明这3种材料亲缘关系较近；ISSR标记聚类结果表明，浙15、心香、S 8、QZ 66聚为一大类。许文停等[18]研究发现，湖南牡丹种质资源的形态学聚类结果与 ISSR 分子标记聚类结果并不完全一致；王鹏等[19]研究表明，部分马铃薯种质材料的形态学标记聚类结果与SSR标记聚类结果的表现不完全一致；刘洪等[20]通过 Mantel 检验发现，花生品种间的形态学性状相似系数与 SSR 标记相似系数的相关性很弱。说明在理论上要完全寻找与形态学性状高度相关的SSR 标记难度很大[21-22]。形态学研究和分子标记研究的结果存在分歧，主要因为两者从不同层面上表现植物遗传多样性，形态学研究主要从植物的表型性状来区分遗传变异和种属之间的差别，受环境和基因共同影响；而分子标记是直接反映种质间的基因型的差异不受基因表达和外部环境条件的影响，其亲缘关系分析结果比较准确[22]。

虽然在形态学研究和ISSR标记研究的分类结果存在不一致现象，但是将两者结合能有效提高品种间特异性的鉴定，更能客观、准确地确定种质资源的亲缘关系。近年来研究表明, 分子标记和形态学性状可在植物分类、品种鉴别及遗传多样性分析中起到互补作用, 尤其对种子的真实性鉴定、同种异名和异种同名鉴别[20]。本研究中形态性状没有将浙75和JS-84区分开，而ISSR标记将两者区分开，位于不同的两大亚类；分子标记聚类将浙6025和浙70聚在一起，而通过形态学聚类结果将两者区分出来。因此, 结合形态学信息和 DNA分子标记信息能有效提高品种特异性鉴定的准确性。总体上本研究中大部分材料被形态学聚类图上被聚到一类的材料在ISSR分子标记聚类图上也被聚在一个类群中，说明部分供试材料的形态学标记与ISSR标记聚类结果在类群划分与遗传背景上具有一致性，形态学性状差异能在一定程度上真实反映基因水平的差异，后续的工作可以通过现代基因组辅助技术，挖掘出这些基因并加以利用，为迷你型甘薯种质资源提供有益的基因资源。

4 结 论

本研究结果表明，部分迷你甘薯供试材料的ISSR标记聚类结果与形态学标记在遗传背景和类群划分上具有一致性，但是两种鉴定分类方法的聚类分析结果也存在一定差异，将形态学及ISSR标记结合能有效提高品种间特异性的鉴定，更能客观、准确地鉴定种质资源的亲缘关系。