PINK1通过磷酸化HDAC3对弥漫大B细胞淋巴瘤CD20表达的影响*

2021-11-24宋晶晶常韬李颖张诗彤

西部医学 2021年11期

宋晶晶常韬李颖张诗彤

(承德医学院第二附属医院，河北承德 067000)

弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)属于非霍奇金淋巴瘤病理类型之一，若未进行及时有效地干预，患者病情进展迅速，其中位生存时间不超过12个月[1]。目前临床通常采用CHOP化疗手段对DLBCL患者进行干预，然而不同类型的患者5年生存率亦具有显著差异[2]。故深入探究DLBCL分型、分子机制及病因对研发新型靶向药物及改善患者预后具有重要意义。PTEN诱导激酶(PTEN-induced putative kinase 1，PINK1)在癌症及帕金森病中经常出现突变，其广泛表达于中枢神经系统、心脏、骨骼肌等器官组织，除此之外，亦可表达于细胞核[3-4]。既往研究显示，PINK1具有提高细胞生存率、抗凋亡及保护作用，这些生物学活性主要是通过线粒体及细胞质中的PINK1发挥作用[5]。组蛋白去乙酰化酶3(Histone deacetylase 3，HDAC3)主要表达于细胞核，其可在细胞核中发挥乙酰化功能并阻断DNA转录[6-7]。CD20可在大部分B细胞恶性肿瘤患者体内检测到，然而在不同类型患者体内差异明显[8]，临床报道表明，CD20阴性DLBCL患者临床预后不良[9]。关于PINK1、HDAC3、CD20在弥漫大B细胞淋巴瘤中的研究报道较少，因此本次研究旨在探究PINK1通过磷酸化HDAC3对弥漫大B细胞淋巴瘤CD20表达的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 DLBCL细胞系OCI-Ly7购于武汉维克赛思科技有限公司，将细胞系置于IMDM培养基(10%胎牛血清、1%请链霉素)中孵育然后放入恒温培养箱中，待其生长至一定密度，将其转移至新培养基进行传代。

1.2 试剂与仪器试剂：IMDM培养基购于武汉益普生物科技有限公司；胎牛血清购于兰州荣晔生物科技有限责任公司；细胞裂解液购于北京伊塔生物科技有限公司；PVDF膜购于北京百奥莱博科技有限公司；ECL化学发光购于沈阳万类生物科技有限公司；抗PINK1、HDAC3、CD20抗体购于北京义翘神州科技股份有限公司。仪器：超净工作台购于上海辅泽商贸有限公司；细胞培养箱购于上海信裕生物科技有限公司；荧光显微镜购于广州科适特科学仪器有限公司；-80℃冰箱购于南京贝登医疗股份有限公司；酶标仪购于北京安麦格贸易有限公司；离心机购于德祥科技有限公司；制冰机购于上海净信实业发展有限公司。

1.3 方法 ①取部分OCI-Ly7细胞系随机分为对照组，sh-PINK1组、sh-Con组，对照组细胞不作任何处理，sh-PINK1组细胞予以PINK1敲低处理，sh-Con组作抑制对照。②提取细胞RNA及总蛋白，采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞PINK1、CD20 mRNA蛋白表达水平。将RNA放入试剂盒内并置于冰上，取提前准备好的新EP管，做好标记后注入0.9mL Trizol，轻轻晃动使其混匀，然后放入离心机中以1500r/min速度离心20分钟，并转移至新EPP管中；将异丙醇注入EP管病震荡15秒，静置10分钟后再次转移至离心机中以1500r/min速度离心20分钟，弃上清液，然后将EPP管放于超净工作台，静置20分钟后进行琼脂糖凝胶电泳或置于超低温冰箱中保存。③采用western blot 检测各组细胞PINK1、CD20、HDAC3、p-HDAC3 Ser424蛋白表达水平。提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白检测试剂盒对其浓度进行检测，并放入-20℃环境下保存。将蛋白取出置于冰上复温，复温后先进行30分钟电泳，然后进行90V恒牙电泳120分钟，经转至PVDF膜后置于摇床，并采用封闭液进行封闭，2小时后加一抗并于4℃环境下孵育过夜，次日取出经TBST洗膜后3次，每次5分钟，加二抗置于自然室温下孵育2小时，取出经TBST洗膜后3次，每次5分钟，然后进行显色及条带分析。分离sh-PINK1组、sh-Con组细胞质及细胞核，采用western blot 检测两组细胞质及细胞核中PINK1、p-HDAC3 Ser424、CD20蛋白表达水平。④取余下OCI-Ly7细胞系随机分为DMSO组、RGFP966组、Con组，Con组细胞不作处理，而RGFP966组细胞采用10μM HDAC3特异性抑制剂RGFP966处理24小时，DMSO组细胞作抑制剂对照。采用western blot 检测各组细胞CD20蛋白表达水平。

2 结果

2.1 PINK1对OCI-Ly7细胞CD20 mRNA及蛋白表达水平的影响 Sh-PINK1组细胞PINK1mRNA及蛋白表达水平显著低于对照组，CD20mRNA及蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)。Sh-Con组细胞PINK1、CD20mRNA及蛋白表达水平与对照组相比差异无显著性(P>0.05)，见表1、图1。

表1 各组OCI-Ly7细胞PINK1、CD20 mRNA表达水平比较

图1 各组OCI-Ly7细胞PINK1、CD20蛋白表达水平比较

2.2 PINK1对OCI-Ly7细胞HDAC3蛋白磷酸化的影响 Sh-PINK1组细胞p-HDAC3 Ser424蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05)。Sh-Con组细胞p-HDAC3 Ser424蛋白表达水平与对照组相比差异无显著性(P>0.05)，见图2。

图2 各组OCI-Ly7细胞HDAC3、p-HDAC3 Ser424蛋白表达水平比较

2.3 PINK1低表达对PINK1、p-HDAC3 Ser424、CD20蛋白表达水平的影响在细胞核中，sh-PINK1组PINK1、p-HDAC3 Ser424蛋白表达水平均低于对照组(P<0.05)。在细胞质中，sh-PINK1组CD20蛋白表达水平高于对照组(P<0.05)，见图3。

图3 各组OCI-Ly7细胞质、细胞核中PINK1、p-HDAC3 Ser424、CD20蛋白表达水平比较

2.4 HDAC3特异性抑制剂对OCI-Ly7细胞CD20蛋白表达的影响 RGFP966组OCI-Ly7细胞CD20蛋白表达水平显著高于Con组(P<0.05)。Con组OCI-Ly7细胞CD20蛋白表达水平与DMSO组相比差异无显著性(P>0.05)，见图4。

图4 各组OCI-Ly7细胞CD20蛋白表达水平比较

3 讨论

临床研究证实，导致DLBCL患者预后不同的原因与其肿瘤分期、病理类型等因素相关。此外，癌基因发生突变、蛋白功能或信号途径发生变化等亦可对其产生一定影响[10-11]。故探究诱发DLBCL起病及进展的关键基因极为重要。

有研究证实，PINK1具有识别及降解受损线粒体的能力，可发挥线粒体质量控制的作用[12]。但在神经退行性疾病及癌症中PINK1通常处于失调状态。CD20是目前临床治疗B细胞恶性肿瘤的靶向药物之一，临床实践显示，利妥昔单抗是一种人/鼠嵌合型抗CD20单克隆抗体，经其干预后大部分DLBCL患者临床预后极差[13]。临床研究显示，PINK1及CD20 mRNA在DLBCL中的表达呈显著负相关[14]。故我们推测，PINK1可能参与调控CD20在DLBCL细胞中的转录。本次研究我们首先对各组细胞系中PINK1及CD20 mRNA及蛋白表达水平进行检测，结果显示，Sh-PINK1组细胞PINK1mRNA及蛋白表达水平显著低于对照组，CD20mRNA及蛋白表达水平显著高于对照组。本研究结果证实，在DLBCL细胞系中，PINK1可通过参与调节CD20 mRNA转录进而达到调控CD20表达的目的。有报道显示，HDAC抑制剂具有促进CD20表达，其主要是通过CD20转录实现的。另有文献报道，在HDAC家族中，只有HDAC3可与PINK1相互作用，PINK1可促进HDAC3的Ser424位点活化及功能；此外，HDAC3通常在细胞核内发挥去乙酰化作用，最终达到阻断DNA转录的目的[15-16]。在本次研究中我们发现，Sh-PINK1组细胞p-HDAC3 Ser424蛋白表达水平显著低于对照组。我们将DLBCL细胞系质核分离，并对其中PINK1、p-HDAC3 Ser424蛋白表达水平进行检测，结果发现，在细胞核中，sh-PINK1组PINK1、p-HDAC3 Ser424蛋白表达水平均显著低于对照组；在细胞质中，sh-PINK1组CD20蛋白表达水平显著高于对照组。说明PINK1具有磷酸化细胞核内HDAC3 Ser424位点的作用，然而HDAC3通常表达于细胞核，故增强HDAC3磷酸化的可能是细胞核内的PINK1。HDAC抑制剂可阻断HDAC去乙酰化功能，其在加速CD20启动子核心组蛋白乙酰化的同时亦可提高转录因子Sp1结合的能力，进而加速CD20转录及蛋白表达[17-19]。临床报道显示，HDAC具有调节CD20转录的能力[20-22]。然而目前关于PINK3通过磷酸化HDAC3是否具有调控DLCL细胞CD20的能力还有待进一步研究。因此本研究采用HDAC3特异性抑制剂对DCBCL细胞进行干预，同时设置DMSO抑制剂对照组，并收集其蛋白对其中CD20蛋白表达水平进行检测，结果显示，RGFP966组OCI-Ly7细胞CD20蛋白表达水平显著高于Con组。说明HDAC3可作为调节CD20表达水平的关键蛋白。