大孔树脂-无机陶瓷膜联用技术对消肿止痛液盐酸小檗碱含量的影响

宫凯敏， 白云凤， 董亚楠， 刘 军

（银川市中医医院，银川 750001）

消肿止痛液（宁药制字Z20140005）处方由地榆、黄柏、五倍子等八味中药组成，临床用于治疗各种原因所致的外痔、内痔及混合痔，疗效确切，深受患者好评[1]。该方由黄柏、芒硝、益母草、乳香、没药、五倍子组成。原剂型为洗剂，纯化工艺较为简单，仅采用高速离心法处理。后期应用于市场中发现，作为复方制剂由于体系中成分复杂，存储过程中易于沉淀、稳定性差，同时洗液存在有效浓度低、使用剂量大且有效成分不易长期吸附于病灶部位，剂型及纯化工艺限制了品种的发展。课题组拟将洗液进行剂型改革开发为软膏剂[2]，通过纯化工艺以增加新剂型载药量。通过查阅文献得知，大孔树脂纯化技术与无机陶瓷膜分离技术目前广泛应用于中药提取液除杂工艺当中，考虑到二者适用性不同，将二者联用发挥各自优势的同时能够极大弥补各自的劣势，故本文对联用工艺进行优选，考虑黄柏为该制剂的君药，所含盐酸小檗碱为其主要活性成分，且通过前期药理试验显示，相同浓度剂量下消肿止痛液与不含黄柏的阴性制剂在大鼠痔疮疗效评价中有差异，故以黄柏指标性成分盐酸小檗碱含量变化作为联用技术筛选的依据。

1 材料

1.1 仪器

1260 系列高效液相色谱仪（美国安捷伦），电子天平（METTLER TOLEDO XS205）；KQ-250 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；十万分子之一电子天平（梅特勒XS205）；无机陶瓷膜设备（江苏久吾，膜材料Al2O3，孔径分别为800 nm、500 nm、150 nm，膜面积 0.5 m2）。

1.2 试剂和药物

盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号：110713-201212）；AB-8、HPD600、D101型大孔树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；消肿止痛液（银川市中医医院制剂，批号20180301）；乙腈为色谱纯；磷酸为分析纯；水为超纯水。

2 实验方法

2.1 色谱条件

采用高效液相色谱法（HPLC）测定，色谱柱：DiamonsilTM（钻石）C18 柱（4.6×250 mm，5 μm）；乙腈∶0.1%磷酸（48∶52）（每 100 mL 加十二烷基磺酸钠 0.1 g），检测波长：265 nm，流速 1.0 mL·min-1，柱温 25 ℃；进样量 10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取消肿止痛液5 mL 置50 mL 量瓶中，加入流动相35 mL，超声处理15 min，放至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液为供试品溶液。

2.2.3 阴性溶液的制备 取消肿止痛液处方中除去黄柏以外的其余药材，按照消肿止痛液处方量、配制工艺及供试品溶液制备方法，制得阴性供试品。

2.3 专属性试验

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性制品溶液各10 μL，按上述色谱条件测定。结果显示，阴性供试品溶液中其他色谱峰对盐酸小檗碱测定无干扰，表明专属性良好，结果见图1。

图1 消肿止痛液专属性考察色谱图

2.4 标准曲线的制备

精密吸取上述对照品溶液 2、4、8、10、15、20 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定。以盐酸小檗碱进样量（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为 Y＝187.6X-3.658（r2＝0.9997）。结果表明，盐酸小檗碱在0.548～5.48 μg 范围内与峰面积积分值线性关系良好。

2.5 精密度试验

取对照品溶液，按上述色谱条件，连续进样6 次，记录峰面积。结果盐酸小檗碱（n=6）为0.98%，表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验

取供试品溶液，按上述色谱条件，分别在0、2、4、8、12、18 h 进样测定，记录峰面积。结果盐酸小檗碱RSD（n=6）为1.97%，表明供试品溶液在18 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批样品适量，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液6 份，按上述色谱条件，分别进样测定含量。结果显示盐酸小檗碱峰面积（n=6）RSD 为2.74%，表明方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密量取已知含量的消肿止痛液10 mL，共6 份，分别精密加入盐酸小檗碱已知含量的0.8倍、1.0 倍、1.2 倍各 2 份，按供试品溶液方法制备样品，按上述色谱条件进样，计算平均加样回收率为98.01%，RSD=2.66%。

2.9 大孔树脂吸附实验及结果分析

2.9.1 大孔树脂型号的筛选 取已处理的3 种型号树脂，其中AB-8 弱极性树脂、HPD600 极性树脂、D101 非极性树脂各10 g，放置于100 mL锥形瓶中，加入消肿止痛液1 mL，其中盐酸小檗碱含量为 4.524 mg·mL-1，计算各树脂 30 min、60 min、120 min 的盐酸小檗碱吸附量、总吸附量及吸附率，结果见表1。

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将上述3 种静态吸附后树脂过滤，滤纸吸干，以不同浓度乙醇各10 mL 依次洗脱，收集各洗脱液，过滤，加入流动性定容至10 mL，微孔滤膜过滤，进样，测定各样品中盐酸小檗碱含量，结果见表2。

由表1 静态吸附结果显示树脂AB-8 与D-101 对消肿止痛液中盐酸小檗碱有较强的亲和力。表2 结果显示相同洗脱溶剂条件下AB-8树脂解吸附效果最好，故选择AB-8 应用于消肿止痛液大孔树脂除杂工艺。

表1 3 种树脂对消肿止痛液盐酸小檗碱的静态吸附数值表

表2 3 种树脂对消肿止痛液盐酸小檗碱的静态洗脱值表

2.9.2 工艺参数考察与优化

（1）大孔树脂纯化正交试验设计。根据静态吸附-洗脱试验，优选AB-8 树脂进行试验，以上样液浓度［A，（g·mL-1）］、大孔树脂用量：上样量（B）、乙醇洗脱剂浓度（C，%）及洗脱剂：上样量（D）为考察因素，以洗脱液中盐酸小檗碱回收率为评价指标，进行4 因数3 水平正交试验，见表3、表 4。

表3 大孔树脂纯化因素水平表

结果表明，以盐酸小檗碱回收率作为考察指标，洗脱剂乙醇浓度对其回收率有影响，从表4中 可知：A2＞A1＞A3，B3＞B1＞B2，C3＞C2＞C1，D2＞D3＞D1，故最佳大孔树脂除杂工艺应为A2B3C3D2，即大孔树脂纯化最佳工艺为：药液质量浓度为1.0 g·mL-1，大孔树脂用量（g）与上样量（mL）比为 8∶1，60%乙醇浓度，洗脱剂（mL）与上样量（mL）比为 8∶1。

表4 大孔树脂纯化正交试验结果

（2）大孔树脂最佳纯化工艺验证。采用上述最佳工艺条件，连续大孔树脂纯化3 批次样品进行验证，结果盐酸小檗碱平均透过率92.12%，RSD 为1.89%，验证该工艺可行性。

2.10 无机陶瓷膜滤过试验

膜分离技术作为近年来中药提取分离的一项技术，原理为以物理“筛分”效应来实现不同分子量物质之间的分离，有研究报道对比过膜前后两种药液的理化性质，除浊度和外观有明显变化之外，其他理化性质基本保持相同，鉴于膜分离技术具有精制效率高、无污染及节约能源等优点[3-6]，目前广泛应用于中药制剂澄清工艺研究。

2.10.1 过膜前药液配制 收集经AB-8 树脂纯化后的药液减压回收乙醇浓缩至0.5 g·mL-1生药量，测定其中盐酸小檗碱含量，用纯化水进行稀释，制备无机陶瓷膜过滤中不同浓度的实验用样品溶液。

2.10.2 无机陶瓷膜过滤正交方案设计 影响无机陶瓷膜过滤效果主要为操作压力即压差、药液浓度、过膜温度与膜孔径4 个因素，实验以压差（E，MPa）、药液浓度［F，（g·mL-1）］、过膜温度（G，℃）、膜孔径（H，nm）为考察因素，进行 4 因素3 水平正交试验，因素水平见表5。

表5 无机陶瓷膜过滤因素水平表

2.10.3 消肿止痛液无机陶瓷膜过滤试验优选 无机陶瓷膜用纯化水处理，排尽体系中清洗液，分别取上述浓度的药液各20 L，泵入无机陶瓷膜过滤系统中进行平衡约30 min，开始过滤，收集过滤液；各操作条件下制备滤液中盐酸小檗碱的透过率见表 6。

表6、表7 结果显示，消肿止痛液经大孔树脂纯化后经无机陶瓷膜过滤，方中指标性成分盐酸小檗碱透过率最低为79.42%，最高为91.23%，盐酸小檗碱整体透过率较高，证明适用于无机陶瓷膜过滤。对表6 实验结果进行方差分析，结果表明：各因素的影响次序为F>H>E>G，因素F、H 均对盐酸小檗碱透过率有影响（P<0.05），其他因素对结果无影响（P>0.05）；确定最佳无机陶瓷膜超滤工艺为 E2F1G2H3，即操作压力 0.2 MPa，药液浓度0.1 g·mL-1，过膜温度 40 ℃，膜孔径 800 nm。

表6 盐酸小檗碱L9（34）透过率正交试验结果

表7 方差分析结果

2.10.4 无机陶瓷膜最佳过滤工艺验证 采用上述最佳工艺条件，连续无机陶瓷膜过滤3 批次样品进行验证，结果盐酸小檗碱平均透过率93.68%，RSD 为1.43%，验证该工艺可行性。

3 讨论

课题前期分别采用水提醇沉法、大孔树脂吸附法及无机陶瓷膜过滤法进行研究，实验结果显示：水提醇沉工艺指标性成分盐酸小檗碱回收率低且浸膏得率高，大孔树脂吸附法盐酸小檗碱回收率高但浸膏得率较高，无机陶瓷膜过滤法盐酸小檗碱回收率高且浸膏得率低，同时膜分离有着无需加热、操作条件温和等优点[7]，但由于药液未进行预纯化，极容易导致膜堵塞污染，膜通量急剧下降。大孔吸附树脂具有选择性好，吸附速度快，分离处理量大，可再生重复使用节约成本等特点，大孔树脂近年来也逐步应用于中药复方制剂的工艺纯化处理[8-10]。综合考虑，选用大孔树脂吸附联用无机陶瓷膜过滤进行消肿止痛液纯化，在此工艺基础上进行软膏剂开发。

消肿止痛液作为中药复方制剂，疗效为多种成分协同作用的结果。本文选用消肿止痛液君药黄柏药效成分盐酸小檗碱作为大孔树脂纯化回收率及无机陶瓷膜过滤透过率效果评价指标性成分，合理可行。处方中剩余药味药效成分大孔树脂纯化及无机陶瓷膜过滤适用性研究及对纯化工艺制备的制剂与原制剂进行等效性评价，将在后续项目中继续进行。目前大孔树脂与膜分离技术广泛应用于中药液体制纯化，药液pH 均对两种技术纯化效果有一定影响，实验过程中也应予以考虑。

本文充分发挥两种技术各自优势，将大孔树脂吸附与无机陶瓷膜过滤联用应用，在确保药效的基础上去除了体系中绝大部分杂质，提高制剂稳定性，增加了有效浓度，为开发新剂型打下基础，同时也为医疗机构中药制剂纯化工艺提供了新的思路和方法。