单胚胎移植策略中胚胎发育潜能的评估方法

刘 芳， 于辛酉， 包俊华， 金 锐， 唐大伟， 白 刚

（1.银川市妇幼保健院生殖医学中心，银川 750001； 2.宁夏医科大学总医院医学实验中心，银川 750004）

目前全世界有700 多万儿童是通过辅助生殖技术出生的。辅助生殖的最终目的是在保护母体安全的同时获得足月健康的婴儿。多胎妊娠有较高的早产风险和更高的并发症发生率，这是在辅助生殖技术应用中一直存在的一个主要障碍。提高妊娠率的同时降低多胎妊娠的风险，是当前辅助生殖需要重点攻克的方向。单胚胎移植在保证妊娠率的同时，可降低多胎妊娠、早产、低出生体质量以及剖宫产的发生率。评估胚胎发育的质量和潜能是提高临床妊娠率的关键步骤之一，是从实验室走向临床的首要指标，也是预测妊娠结局的有力证据。因此，避免多胚胎移植并选择高质量的单胚胎进行移植，在近些年也得到更广泛的认可和发展。

选择移植最有发育潜能的胚胎在辅助生殖过程中是非常重要的，而如何能够安全无创、快捷有效地选择出最适合的胚胎，已成为当前胚胎移植研究的热点。目前临床上已经有许多质量评价方法，包括传统的形态学和近几年发展的代谢组学、延时监测技术和基因组学等评价方法，现对近期各种研究结果综述如下。

1 代谢组学方法

代谢组学是继基因组学、蛋白质组学和转录组学之后发展起来的一门学科，它很好地反映了基因表达下游的事件，并提供了有关细胞内代谢有价值的信息，这是其他组学技术无法做到的。它能反映机体的动态代谢状态，因此可以检测疾病与药物作用的相关性。代谢组学大概能测定3000 种代谢物，数据量远小于蛋白组和转录组，相对而言分析可以更快[1]。目前常用的分析技术包括核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、拉曼光谱（Raman）、近红外光谱（near infrared，NIR）、质谱（mass spectrometry，MS）、色谱（chromatography）和色谱—质谱联用技术[2-3]，它们在测定不同代谢物上各有优势。由于代谢物种类繁多，各物质之间差异比较大，且浓度分布范围广，仅靠一种分析技术无法完成。目前已知总体质量差的胚胎移植与单胎出生体质量的降低有关，而评估胚胎总体质量需要全面测定胚胎的各种代谢物[4]。因此，临床上常联合使用几种分析技术对代谢产物进行全面分析[5]。预测胚胎发育潜能相关，且研究较多的代谢产物，主要源于以下几个微环境。

1.1 卵泡液

卵泡液是指发育中卵母细胞的体内微环境，包含对卵泡生长和卵母细胞成熟至关重要的所有成分以及卵母细胞排出的代谢物。卵泡液的代谢组成一定程度上反映了卵母细胞的质量[6]。Piñero-Sagredo 等[7]首次利用 NMR 研究人体卵泡液，鉴定出一些能作为卵泡成熟状态的生物标记物的代谢物，选择出具有更高受精潜能的卵母细胞，提高体外受精（in vitro fertilization，IVF）的成功率。McRae 等[8]利用NMR 技术对10 名接受自然周期IVF 女性中的卵泡液进行分析，发现排卵期的卵泡液为高水平的乳酸、丙酮酸和低水平的葡萄糖。有研究[9]通过气相色谱/质谱（GC/MS）的代谢组学方法，比较IVF 成功和IVF 重复失败（RIF）患者卵泡液的代谢物，发现RIF 卵泡液组几种氨基酸（缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、脯氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸和鸟氨酸）水平升高，二羧酸、胆固醇和一些有机酸水平降低。但卵泡液作为辅助生殖的生物标记物，目前仍有明显的局限性。比如，卵巢刺激过程或冲洗介质都可以改变卵泡液的成分[10]。由此可见，关于卵泡液的代谢组学分析的研究还处于起步阶段，要实现卵泡液的整体代谢组学图谱的临床应用还需要更多的研究。

1.2 胚胎培养基

如今在临床实践中，快速经济的胚胎质量评估方法仍是形态学评估和卵裂率。胚胎质量的生物标记可以克服形态学评估的一些弱点。胚胎培养基（embryo culture medium，ECM）的研究表明，胚胎之间的代谢差异可能表明了受精成功的潜力，但其在临床应用方面的意义仍有待商榷[11]。Vergouw 等[12]使用近红外光谱（NIR）对培养基进行代谢组学分析，选择第3 天的胚胎，与仅通过形态学选择胚胎相比，试管婴儿的活产率无差异。Hardarson 等[13]的研究表明，在胚胎形态中加入ECM 的近红外光谱并不能提高单胚胎移植（SET）后第2 天和第 5 天的妊娠率。Sfontouris等[14]研究发现基于NIR 仪器进行的ECM 代谢组学分析对第2、3 和5 天的妊娠率和活产率均无有利影响。以上研究表明，与仅使用形态学相比，将ECM 代谢组学分析加入形态学并不能提高获得可行妊娠的概率。

1.3 子宫内膜

人类子宫内膜是一个动态组织，在自然月经周期的短时间内接受着床，称为“着床窗口”。这个窗口随着月经周期的长短而变化，与正常周期19～21 d 一致。在同一周期内抽吸子宫内膜液可以不影响着床或妊娠率，这意味着子宫内膜的代谢组学分析可以与胚胎移植在同一周期内进行[15-16]。识别与子宫内膜容受性相关的生物标记物在临床上是可取的，可影响辅助生殖治疗患者的妊娠率。

2 延时监测系统

延时监测技术是一种对辅助生殖过程中胚胎形态和发育动力学进行半定量评价的新技术，是否具有临床应用价值尚无定论[17-18]。传统上，胚胎评估是指将胚胎从常规培养箱中取出，每天在光镜下镜检来进行评估。延时系统是指频繁地拍摄胚胎的数字图像，将延时记录技术与临床实践相结合，使胚胎学家在不干扰胚胎培养的同时，对胚胎发育有更深入的了解。使用带有形态动力学算法的延时摄影系统可以显著改善妊娠和活产率，并减少早期妊娠损失[19]。Rubio 等[20]研究发现，在综合胚胎镜延时监测系统中培养和选择胚胎的方法改善了生殖结果。延时监测系统组的持续妊娠率增加至51.4%，标准组的持续妊娠率为41.7%。Adamson 等[21]对基于 TLM 系统的第 3 天胚胎移植研究发现，与仅基于形态学分析比较，试验组的胚胎移植率和临床妊娠率高于对照组。除了鉴定具有高植入潜能的胚胎外，延时分析还揭示了常规静态形态学评估所遗漏的异常事件。多核、直接卵裂（1～3 个细胞直接分裂）和反向卵裂等特异事件均被发现与植入电位降低有关[22-25]。而在 Goodman 等[18]的研究中，添加延时形态动力学数据并未改善临床生殖结果，临床妊娠率和着床率总体上与囊胚转移相似。因此，延时诊断系统提供了有关胚胎质量的宝贵信息，可帮助临床医生选择胚胎进行单胚胎移植。延时监测技术中，标准化的观测时间还没有一个确切点，但这一点在临床上是至关重要的。因此也需要更多的科研数据进一步确定这一观测时间点，以方便延时检测技术在临床上更广泛地使用。

3 胚胎植入前遗传筛查

遗传信息的载体——染色体是影响胚胎发育潜能的重要因素，年龄超过40 岁的女性的染色体异常率≥50%。染色体异常对胚胎发育或胎儿发育有致死效应，因此在辅助生殖过程中，染色体筛查可提高染色体异常患者的临床妊娠率和降低自然流产率，尤其适用于高龄产妇。目前染色体筛查的主要方法是植入前非整倍体遗传检测（PGT-A），也称为 PGS[26]。PGS 通过分析全部24 条染色体的拷贝数，以筛查胚胎非整倍性改变。Forman 等[27]纳入了 175 名年龄≤42 岁的体外受精夫妇，一组接受单整倍体胚胎移植，另一组接受未活检的双胚胎移植。结果显示，前者的多胞胎接生率远低于后者。通过对35 岁及以上的妇女使用 PGS，多胎妊娠率明显降低[28]。Kang 等[29]研究发现，在年龄≤37 岁的女性中，IVF-PGS 对活产率和流产率无影响；但在年龄＞37 岁的女性中，IVFPGS 确实改善了临床妊娠率和活产率。但另有研究[26]显示，PGS 第3 天活检对胚胎有侵袭性，可能会导致胚胎嵌合，而这种胚胎嵌合现象会严重干扰PGS 的结果解读。新一代测序（NGS）正在取代最初PGS 中的荧光原位杂交技术（FISH），减少对胚胎的侵袭性，且具有精度高、成本低的优点，但仍会导致胚胎嵌合。因此，PGS 作为体外受精患者筛选技术的价值还有待确定[30]。

越来越多的辅助生殖接受者在临床咨询后，患者对怀孕可能性的重视程度降低，而对孕产妇和围产期风险的重视程度增高。在咨询之后，大量的接受者会选择单胚胎移植[31]。对胚胎质量进行科学的评估是保证妊娠率的一个重要方法。传统的形态学和近几年发展的代谢组学、延时监测技术和基因组学等评价方法，在临床应用上各有优势。这可能与胚胎的发育潜能受多种因素影响、不同年龄的妇女卵母细胞质量不同等有关，最终导致各种检测方法得到的结论不一致。故单一的形态学指标不足以预测胚胎的最终结局，需要从更多维度和更多水平来综合评价。因此，在保证无创准确、高效快速的基础上，合理利用筛选方法十分重要。此外，还需要更多的临床研究结果，让患者、医生和卫生保健工作人员相信，即使单胚胎移植可能稍微延长了受孕的时间，选择性单胚胎移植对母体和胎儿总体影响要优于多胚胎移植。