电火花沉积内植体微槽表面抗菌改性

梁智杰，郭钟宁，严银银，黄钦明，勾俊峰，刘江文

（广东工业大学省部共建精密电子制造技术与装备国家重点实验室，广州 510006）

0 引言

随着科技发展，内植体市场需求不断增加。内植体是制造用于替换缺失的生物结构，支持受损的生物结构或增强现有生物结构的医疗装置[1]。临床上内植体使用材料最多的依然为金属材料[2]。医用金属材料现在亟待解决的问题之一是抗菌问题[3]。研究表明用于骨科的金属植入体在植入手术后发生感染的几率达0.5%～9%[4]。医用金属主要采用钛基材料，具有高强度、低密度（高比强度）、高耐腐蚀性、对人体环境的完全惰性、较高的生物相容性、低模量和高骨亲和能力[5]。应用范围包括但不限于用于正畸手术的牙齿植入物和零件、关节置换零件、用于起搏器和人造心脏瓣膜的容纳装置、高速血液离心机中的仪器和组件等[6]。抗菌材料分为金属与非金属，金属的抗菌材料以Ag＋、Cu2＋、Zn＋等为代表的泛用抗菌剂[7]，非金属以各类合成药物例如环丙沙星等为代表的大分子合成物。

对于在植入体表面添加抗菌材料的研究一直没有停歇。Keynoosh等[8]采用溶胶-凝胶法制备了含银、氟、羟基磷灰石（Ag-FHA）的复合涂层，加工后复合材料的抗菌性能显著提。Hadidi等[9]通过电化学方法制备了羟基磷灰石-铜纳米复合材料，作为生物医学应用的抗菌涂层。Vaithilingam等[10]提出了一种利用选择性激光熔融在Ti6Al4V结构表面吸附膦酸自组装单分子膜固定环丙沙星（抗菌药物）的方法，涂层抗菌药物敏感性实验表明该药物释放后具有治疗活性。秦升[11]使用阳极氧化的方法在钛表面制备二氧化钛的纳米管，再在纳米管中负载依诺沙星。Bai等[12]采用脉冲直流磁控溅射法制备了不同Ag含量（1.2%～1.6%）的纳米Ti-Ag涂层，涂层获得良好的抗菌活性。此外还有利用机械加工的方法使钛表面获得抗菌性能[13]。内植体表面的抗菌改性技术还存在一些关键技术问题亟待解决：（1）需要多步工艺，制备过程复杂；（2）抗菌材料与基体材料结合不牢固容易脱落，稳定性差；（3）抗菌材料的抗菌效果持续性能差。

针对上述的问题，本文提出了一种使用电火花沉积加工的方法，将银作为抗菌材料添加到金属植入体中。该方法使用银丝作为电极，通过电极刷实现多点放电沉积的方式，在带有沟槽的复杂形貌表面放电沉积，从而实现提升内植体表面的抗菌性能。该方法通过采用柔性的银丝作为工具电极，适用于各种复杂的表面形状，具有制备工艺简单，成本低，适应性强等优点。此外通过电火花沉积加工后的样品表面的银稳定性良好，能持续水解产生银离子作为抗菌剂，保证抗菌的持续性。本研究对制备表面的表面成分、微观形貌、抗菌性能、抗菌机理进行分析。

1 材料与方法

1.1 试验设备与材料

试验中基材材料选用TC4钛合金（Ti6Al4V），样品首先被加工成具有正弦波性结构的微槽。带有微槽结构的表面更有利于与细胞黏附[14]，所以本研究采用带有微槽的复杂结构进行研究。试验设备使用上海旗雄自动化科技有限公司的Hz3k-100A的金属冷焊修复机作为沉积电源。使用银丝制备成的银丝刷作为工具电极连接到电源的正极。微沟槽工件作为阴极连接到电源的负极。

1.2 加工条件

尽管银具有良好的抗菌性能，但在实际处理中体内大量的银也会引起例如排斥反应和体内细胞毒性的不良反应。为了研究含银量不同的微槽表面的抗菌效果与细胞相容性之间的关系，需要弄清楚不同工艺参数对微槽表面电火花沉积的影响。电火花沉积过程通常受工具电极和加工的电参数影响。实验条件如表1所示。

表1 电火花沉积改性工艺参数Table.1 ESDmodification processparameters

1.3 检测方法

使用X射线衍射仪（D8 ADVANCE，Bruker，德国）测量加工后样品表面的物相组成。已制备样品的表面形貌使用激光共聚焦显微镜（OLS4000，奥林巴斯，日本）在快速扫描的条件下获得。样品的表面形貌利用扫描电子显微镜（S-3400N，日立，日本）在10 kV加速电压下观测得到。使用电感耦合等离子体质谱（ICAP RQ，Thermo Fisher，德国）定量检测银离子释放能力。使用抑菌环试验与平板菌落技术法测定样品的抗菌能力。

2 结果与讨论

2.1 物相组成

图2所示为丝径为0.2 mm，电压为45 V，脉宽为50μs，频率为50 Hz，加工时间为1 min条件下电火花沉积后的含银微槽表面的XRD图。图谱为2θ角范围为0°～90°，记录所得。将测量数据衍射峰与标准物质衍射峰对比匹配。可以发现样表面的物相主要由银和钛组成。

图2 样品的XRD图谱Fig.2 XRDpattern of thesample

2.2 表面形貌

2.2.1 电压对微沟槽表面的影响

实验在50、55、60、65、70 V电压下进行，频率和脉冲宽度分别固定为60 Hz和50μs。图3所示为不同电压下电火花沉积后的微槽表面形貌和对应截面曲线。在电压较低的时候，银沉积较为均匀微槽的表面形貌并没有太大改变，能保持原来的形貌。随着电压的增大，放电变得剧烈银沉积量增加，微槽表面会被大量银沉积物覆盖，微槽原本的形貌会大幅改变。

图3 不同电压电火花沉积加工后微槽表面形貌Fig.3 Topography of themicrogrooveswith different voltage

图4 所示为不同电压下样品的SEM图。在较低电压的情况下银的沉积分布分散。对比不同沉积电压下电火花沉积后微槽表面形貌，随着电压增大，沉积的银的尺寸增大。在较大电压的情况下（50～60 V）的时候，会出现银尺寸的复合结构，在较大尺寸的银沉积物表面会存在小尺寸银沉积物。但电压较大的情况下，加工后微槽的表面形貌会发生很大的改变。采用较小的电压（40～45 V）加工，微槽的表面形貌并没有太大的改变，沉积的银尺寸较小，数量多。

图4 不同电压电火花沉积加工后微槽SEM图Fig.4 SEMimagesof thesamplesurfacewith different voltage

2.2.2 脉宽对微沟槽表面的影响

改变脉宽研究加工中沉积电源放电脉宽对沉积的影响。实验在30、40、50、60、70μs脉宽下进行，电压和频率固定为50 V和60 Hz。图5所示为经过不同脉宽下加工后微槽的表面形貌和对应的截面曲线。在较小的脉宽的情况下放电的时间较短，银沉积不均。当脉宽增加到50μs时，加工后微槽表面银沉积均匀，表面形貌没有发生较大的改变。当脉宽持续增加时，银沉积的量大幅增加，微槽表面形貌大幅改变。

图5 不同脉宽电火花沉积加工后微槽表面形貌Fig.5 Topography of themicrogrooveswith different pulsewidth

图6 所示为不同脉宽下样品的SEM图。随着脉宽的增大，沉积的银的数量增加。在较大脉宽的情况下（60～70μs）的时候，微槽上的银沉积物主要为大尺寸（＞100μm），且沉积的银分布不均匀。在较小脉宽（30～50μs）的情况下沉积的银主要为小尺寸（10～15μm）为主，在50μs脉宽的情况下整体观察下银沉积较为均匀，但通过扫描电镜高放大倍数下能观察到沉积物并不是均匀的，存在一定的过加工区域。

图6 不同脉宽宽电火花沉积加工后微槽SEM图Fig.6 SEMimagesof thesamplesurfacewith different pulsewidth

2.2.3 频率对微沟槽表面的影响

实验在40、50、60、70和80 Hz频率下进行，脉宽和脉冲宽度固定为50 V和50μs。图7所示为不同频率条件下加工后的微槽表面形貌和对应的截面曲线。频率在40 Hz的时候，微槽的表面银沉积并不均匀，部分的微槽顶部会出现多次加工的情况。对应的截面曲线也能观察到这种现象，部分波峰的曲线出现下凹的情况。在50 Hz的时候，加工后微槽的表面形貌并无太大改变，并且银沉积均匀。将频率增加到60 Hz，微槽表面沉积的银增加，对应的截面曲线有所改变，具体表现为曲线更平，曲率减少。当频率继续增加到了70 Hz的时候，微槽表面形貌开始发生较大改变。截面曲线会显示带有类似杂波的正弦波曲线。频率增大到80 Hz后，银沉积的量增大，在微槽上的银大幅改变了微槽的表面形貌。相对的截面曲线变得更加扁平。

图7 不同频率电火花沉积加工后微槽表面形貌Fig.7 Topography of the microgrooves with different wire diameter of frequency

图8所示为不同频率下样品的SEM图，对比不同频率下电火花沉积后微槽表面形貌可以发现随着频率的增大，沉积的银的数量增加。对比不同频率下电火花沉积后微槽表面形貌，随着频率的增大，沉积的银的数量增加。在较大频率的情况下（70～80 Hz）的时候，微槽上的银沉积物主要为大尺寸，沉积物覆盖整个微槽的表面。在较小脉宽（40～60 Hz）的情况下沉积的银主要为小尺寸为主，随着频率增大，在微槽上沉积的银的数量逐渐增加。

图8 不同频率电火花沉积加工后微槽SEM图Fig.8 SEMimagesof thesamplesurfacewith different frequency

2.3 表面粗糙度

使用激光共聚焦显微镜（OLS4000，日本，奥林巴斯）附带的粗糙度测量，在精细扫描条件下，对每个样品随机选取10个不同的区域进行测量取平均值。结果如图9所示，未加工的微槽为2.09±0.367μm。

图9 样品粗糙度Fig.9 Sample Roughness

从结果看，加工后的微槽相比未加工的微槽粗糙度有所上升。在改变电压的条件下，加工后样品表面的平均粗糙度相差不大，但当电压达到60 V时，出现较大的偏差，部分区域最小粗糙度与最大粗糙度相差达3μm。在改变脉宽的条件下，在脉宽为50μs时样品表面粗糙度相对其他脉宽参数具有最高值，且偏差也为最大。结合表面形貌可以得知，在50μs时每一次放电增加，每一次放电生成的银沉积物大小增加，但这些尺寸加大的银沉积物在微观上并没有大量相连，大多数的银沉积物独立存在。随脉宽增大，银沉积物的大小增加并且更多的银沉积物连成片，样品表面粗糙度反而下降。综合以上因素，在脉宽为50μs条件下加工后表面相对其他脉宽参数具有最大的粗糙度，且偏差较大。在改变频率的条件下，使用不同参数加工后样品的表面粗糙度相差不大。但在40 Hz与80 Hz的条件下粗糙度偏差较大。

2.4 抗菌性能

通过对各稀释梯度接种培养后的培养基进行平板计数。为了研究不同电参数下电火花沉积含银微槽表面的抗细菌黏附效果，实验选择了典型的革兰氏阴性菌E.coli和革兰氏阳性菌S.aureus作为测菌种。实验中将样品放置在干净玻璃培养皿中，再分别对应加入10 mL浓度为8×107CFU/mL的E.coil菌液与10 mL浓度为8×107CFU/mL的S.aureus菌液，放入37℃恒温孵育箱中培养24 h。之后取出样品，用生理盐水冲洗表面，再放入超声清洗洗脱表面黏附的细菌，对洗脱液进行平板菌落培养。图10所示为抗菌试验的结果。

图1 设备与材料Fig.1 Equipment and materials

图10 不同加工参数下微槽抗菌率Fig.10 Antibacterial rate of microgrooves under different processingparameters

变量为电压的第一组中，样品在抗大肠杆菌的实验中都有良好的效果，整体抗率都能在90%以上。结合微槽表面形貌的观察，在较小电压进行加工的情况下，微槽表面的银沉积较为均匀，表面的形貌基本保持原来的形貌，且抗菌效果较好。第二组样品中变量为脉宽，在抗大肠杆菌的实验中都有良好的抗菌效果。结合表面形貌的观察结果分析，在放电脉宽较低的时候，放电时间较短，能形成的银沉积物的尺寸较小、分布不均匀。随着脉宽的增加，银沉积物尺寸和数量增加，但大尺寸的银沉积物的抗菌能力比小尺寸的银沉积物差。第三组样品中变量为频率，在抗大肠杆菌的实验中都有良好的抗菌效果。当变量为频率时，所观测到的规律与前两组变量类似：当频率增大，加工后样品的抗菌能力下降。通过对比不同频率电火花沉积后微槽的表面形貌可以得知：在频率较低的时候（40 Hz），放电加工不均匀，导致银的沉积不均匀最终影响了样品的抗菌效果。但是当频率增大到60 Hz或更高时，放电加工覆盖微槽的全部区域，银沉积的量也逐渐增加。在一些区域会出现多次放电，多次沉积的现象。直观表现为通过电镜观察，会发现沉积的银的数量增多，尺寸明显增大。在较高的频率下大量的银沉积会在放电中重新融熔形成大尺寸的银沉积物。

2.5 抗菌机理

银通过水解生成银离子作为抗菌剂产生抗菌效果[15]。选取电压参数为40 V、50 V、60 V与未加工样品，放入模拟体液（SBF）10 mL中浸泡24 h，使用电感耦合等离子体质谱（ICAPRQ，Thermo Fisher，德国）对样品浸泡后溶液的银离子浓度进行检测，检出限ppb为0.019，定量限ppb为0.063。结果如图11所示。

图11 溶液中Ag＋浓度Fig.11 Ag＋concentration in solution

样品中Ag＋离子浓度分别为：空白对照0μg/L，40 V样品0.22μg/L，50 V样品0.13μg/L，60 V样品0.126μg/L。浸泡后溶液中银离子浓度随电压的增大而减少。在低电压的加工参数下，银沉积物的尺寸较小，在模拟体液中容易水解生成Ag＋。同过对样品的物相与化学组成分析，样品表面同时存在银单质与氧化银。加工后样品表面的银于空气中的氧结合反应生成氧化银。所以在模拟体液浸泡时，样品析出银离子分为两个阶段。第一阶段，银的氧化层遇水水解成银离子，反应如式（1）所示。第二阶段氧化银水解完成后，银接触水发生水解，具体反应如式（2）所示。

3 结束语

本文使用电火花沉积加工方法可以使得内植体表面获得抗菌能力，并且这种方法可以适用在复杂的表面形貌中。

加工的工艺参数对加工后样品的抗菌性能有很大影响，采用较低的电压、脉宽、频率加工后的表面银沉积物尺寸较小，抗菌效果更好。

小尺寸的银具备更良好抗菌性能的原因是因为其相较于大尺寸的银沉积具有较大的比表面积，在溶液或体液中更容易水解产生银离子，抗菌性能由银离子提供。