气滞血瘀型肝癌用药规律分析及核心药对作用机制的网络药理学研究*

梁子成，龙依萍，张曾宇，黄晓蒂，陈泓秀，文 璐，田雪飞，田 莎

（湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率居世界前列，且预后普遍较差[1]。目前肝癌的首选治疗方法是化学疗法与免疫治疗，但仍存在不可忽视的缺陷[2]。因此，寻求安全有效的抗肝癌药物极为迫切。肝癌在中医学归属于“伏梁”“积聚”范畴，其可因外邪入侵、饮食内伤、情志因素所致，与气血津液代谢密切相关[3]。中医药治疗肝癌具有疗效显著、不良反应小等优势[4]。中医将肝癌分为5个证型，其中气滞血瘀证是最主要的证型，通常贯穿肝癌全病程[5]。气滞血瘀既是肝癌发生的危险因素，也是影响肝癌病程进展的病理因素。气为血之帅，能生血、能行血，故气滞可致使血瘀；且肝主疏泄，气滞可致使肝郁，肝郁可加重肝病程度。血为气之母，能载气、养气，故血瘀可致使气机循环失畅；血可濡养脏器筋脉，血瘀可致使肝脏失濡养，故血瘀可加重肝病。中医对于气滞血瘀证与肝癌的关系尤为重视，因而治疗气滞血瘀型肝癌方药及报道诸多，然对于治疗气滞血瘀型肝癌的用药规律尚不统一。本研究采用数据挖掘的方法对收集到的治疗气滞血瘀型肝癌的用药处方进行分析，探讨中医治疗气滞血瘀型肝癌的用药规律，并运用网络药理学的方法探讨关键药物组合治疗肝癌的潜在机制，以期为临床治疗和理论研究提供可靠参考。

1 资料与方法

1.1 中药处方来源中药处方通过在中国知网、维普、万方数据库输入“肝癌气滞血瘀”“气滞血瘀证”“肝癌”“中药”“中药治疗”“中医治疗”等关键词联合检索获得。通过题名和摘要浏览进行初筛，全文浏览进一步精筛获得初步数据，后根据资料纳入与剔除标准获得符合要求方剂95首。

1.2 资料筛选

1.2.1 纳入标准（1）公开发表的包含中药治疗气滞血瘀型肝癌的文献报道；（2）报道处方完整，有明确中药组成，确切剂量，处方药物组成符合气滞血瘀型肝癌证候治疗需求；（3）报道疗效确切。

1.2.2 剔除标准（1）排除综述、动物实验、理论探讨所得方剂；（2）排除采用单味药方剂、单用或合并中成药治疗报道，如斑蝥胶囊等；（3）排除联合中医其他治法的报道，如艾灸、针刺等；（4）排除服药方式非内服报道，如敷贴等；（5）重复发表取其一，同药物组成且同剂量而异名的处方取其一。

1.3 处方药物名称规范为排除因药物别名、炮制方法、药物剂型等对后续分析产生干扰，根据《中华人民共和国药典》[6]（2015版）、《中药学》[7]对处方药物的名称进行规范化处理，如洋火叶、仙灵脾、淫羊藿统一为淫羊藿，姜半夏、法半夏、半夏统一为半夏，附片、附子统一为附子。

1.4 资料录入核对与分析将“1.2”及“1.3”处理后的方剂录入中医传承辅助平台（V2.5），为确保信息准确完整录入，由两人对输入前文件进行反复检查，输入过程中交替进行并两人监督。录入完成后请第三人对录入结果进行检查。数据录入完成后，运用“数据分析”“统计报表”系统进行数据分析。

1.5 关键药物组合治疗肝癌的机制分析从TCMSP数据库、TCMID数据库以OB≥30%、DL≥0.18获取药物成分，联合Pubchem数据库和SwissTargetprediction数据库获得新处方作用靶点（https://tcmspw.com/tcmsp.php、http://www.megabionet.org/tcmid/、https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/、http://www.swisstarget prediction.ch/）。关键药物组合作用靶点与GEO数据库GSSE121248芯片的差异基因取交集获得治疗肝癌的潜在靶点。利用STRING平台（https://string-db.org/）进行蛋白互作分析，借助DAVID 6.8数据库进行GO功能与KEGG通路富集分析，使用Cytoscape 3.8.0软件进行调控网络构建。

2 结 果

2.1 用药频数≥15的中药对过滤后的95首方剂进行频数统计分析，获得频数≥15的中药29味。（见表1）四气以寒[37.79%（506/1 339）]、温[34.21%（458/1 339）]、平[24.50%（328/1 339）]为主，五味以苦[35.61%（745/2 092）]、甘[30.98%（648/2 092）]、辛[24.33%（509/2 092）]为主，归经以肝[20.26%（743/3 668）]、脾[19.22%（705/3 668）]、胃[13.55%（497/3 668）]为主。（见图1）

表1 用药频数≥15的中药

图1 药物的性味归经分析结果

2.2 处方规律分析应用平台进行处方规律分析，获得用药频数≥18的药物组合23个（见表2），提取置信度≥0.6的组合关联规则信息（见表3），并将关联规则网络可视化（见图2）。结合表2～3分析结果可发现，“红花-桃仁”组合频数居前列且置信度最高，故将“红花-桃仁”组合定义为关键药物组合。

表2 用药频数≥18的药物组合

表3 处方中药物组合的关联规则（置信度≥0.6）

图2 关联规则网络可视化

2.3 基于复杂熵聚类的核心组合分析复杂系统熵聚类[8]（相关系数=5，惩罚系数=2）分析获得，核心组合共计13个。（见表4）

表4 核心组合的复杂熵聚类分析结果

2.4 新处方的无监督的熵层次聚类分析提取“2.3”结果，通过无监督的熵层次聚类分析获得新方相关核心组合8个，新处方4个。（见表5～6）

表5 新处方聚类核心组合

表6 治疗气滞血瘀型肝癌的新处方

2.5 “红花-桃仁”治疗肝癌的机制分析

2.5.1 肝癌的差异基因表达及“红花-桃仁”治疗肝癌的潜在靶点蛋白互作分析 从GEO数据库下载GSE121248芯片分析获得差异基因（见图3A），与“红花-桃仁”作用靶点取交集获得“红花-桃仁”组合治疗肝癌的潜在靶点（见图3B）。经STRING平台蛋白互作分析后利用Cytoscape 3.8.0软件CytoNCA插件进行分析。结果显示靶点CDK1、CCNA2、AURKA、TOP2A、AURKB、KIF11、CDC25C、CHEK1、TTK、WEE1居前十位。（见图3C）

图3 “红花-桃仁”治疗肝癌的潜在靶点获取及蛋白互作分析

2.5.2 潜在靶点的富集分析结果 利用DAVID 6.8对治疗潜在靶点进行GO功能与KEGG通路富集分析。（见图4）GO靶点功能分析包括生物过程（BP）、细胞定位（CC）与分子功能（MF）。GO功能分析结果显示潜在靶点的生物过程富集结果主要在类固醇代谢过程（steroid metabolic process）、氧化还原过程（oxidation-reduction process）、对药反应（response to drug）等；细胞定位富集结果主要在胞质溶胶（cytosol）、核质（nucleoplasm）、细胞器膜（organelle membrane）等；分子功能富集结果主要与药物结合（drug binding）、类固醇激素受体活性（steroid hormone receptor activity）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）等相关。KEGG通路富集结果显示潜在靶点主要参与HIF-1信号通路、p53信号通路、PPAR信号通路、TNF信号通路等。

图4 潜在靶点的富集结果

2.5.3 “红花-桃仁”治疗肝癌的“药物-成分-靶点-通路”调控网络构建 利用Cytoscape软件构建“红花-桃仁”治疗肝癌的前20条通路的多层次调控网络。网络包含130个节点与499条边，其中成分33个，前20条通路相关潜在靶点75个。（见图5）

图5 药物-成分-靶点-通路调控网络

3 讨 论

肝癌是指发生在肝细胞或肝内胆管细胞的恶性肿瘤，其发生多伴随有结节、肿块等病理产物，与中医“癌肿”“癥瘕”相合[9-10]。气滞血瘀证是肝癌的常见证型，在肝癌发生的全过程都可出现[5]。气滞血瘀的发生可导致一系列临床症状的出现，气滞可阻滞血络，则瘀血内生，又可逆阻痰气，致使痰瘀互结，聚于胁下，日久呈积；肝主疏泄，气机阻滞，肝气不疏，木横侮土，脾失健运，痰湿内生。瘀血可因气滞而成，又可加重气滞，瘀血内阻可化热内灼，耗气伤阴，败血痰湿煎灼可生内毒，热毒熏灼胆汁可致发黄；瘀血堵络，津液代谢失运，瘀血水湿互结可致鼓胀[11-12]。由此可见，气滞血瘀可致气血水湿互结，毒热内灼，加重患者病情，故对肝癌的气滞血瘀证的合理施治尤为重要。

本研究筛选获得治疗气滞血瘀型肝癌的方剂95首，共227味中药，其中使用频数≥15的中药29味，即补气药：白术、甘草、黄芪、党参；理气药：枳壳、香附、陈皮、枳实；活血药：桃仁、丹参、莪术、郁金、红花、川芎、穿山甲、延胡索、三棱；补血药：当归、白芍；清热药：白花蛇舌草、赤芍、牡丹皮、半枝莲；补阴药：鳖甲；消食药：鸡内金；利水渗湿药：茯苓、茵陈、薏苡仁；解表药：柴胡。以上药物分类体现了气滞血瘀型肝癌用药的重点在于调理气血，其治法在于“理气活血以化瘀、补益气血以生新”。95首方剂中227味中药的性味归经分析结果显示，药物以寒性、温性、平性药物为主，苦味、甘味、辛味药物居多，入肝经、脾经、胃经药物占比较大。苦寒、甘温可清热、除热，气滞血瘀型肝癌瘀血内阻，热毒内盛，清热除热可减少气阴耗损、内息毒热；热毒损耗气阴，而甘寒可养阴，使气血化生有源；辛味可助发散、行气、行血，利于气滞血瘀证的治疗，由此可见性味分析用药结果的合理性。中药多入肝经、脾经、胃经，病在肝体，久病必然折损肝体，入肝经之药既可补益肝体，又可助肝之疏泄等功能恢复。入脾胃经利于健脾益气、运化痰湿，可针对性地治疗气血水互结病机。因而高频组合与核心组合多以苦寒、入肝经药物组成，其亦是中医治疗气滞血瘀型肝癌的清热化瘀、补肝体治法思想体现。新处方（4）尤为体现这一思想，其主要药物与《医林改错》的血府逐瘀汤极为相似。以生地黄清热凉血，牛膝引瘀血下行，桔梗行气载药，桃仁、红花活血祛瘀，白术益气化痰饮水湿，然牛膝又可补肝肾，生地黄可滋阴养血[13]。这与古代中医名家治疗思想相合，故所得新处方可对当代临床用药提供较良好参考。

针对“红花-桃仁”组合治疗肝癌的机制探索发现位居前十的潜在靶点分别为CDK1、CCNA2、AURKA、TOP2A、AURKB、KIF11、CDC25C、CHEK1、TTK、WEE1。LIU H M等[14]通过运用miR-1271-5p靶向CDK1可抑制细胞增殖、改变细胞周期分布并增强肝癌细胞系的放射敏感性。JIN X H等[15]研究发现抑制AURKA-mTOR-eIF4E轴、降低AURKA表达可在肝癌细胞中发挥抗肿瘤作用。CAI H等[16]通过分析肿瘤组织与癌旁组织发现TOP2A在肿瘤组织中的表达明显高于癌旁组织，提示TOP2A的表达水平与肝癌病程进展与不良预后相关。其余部分靶点亦存在与肝癌相关的报道。潜在靶点的通路富集主要与HIF-1信号通路、p53信号通路、PPAR信号通路、TNF信号通路等相关。现有的研究表明HIF-1信号通路、p53信号通路、PPAR信号通路、TNF信号通路与肝癌细胞凋亡、肿瘤代谢、肿瘤炎症免疫及疾病预后密切相关，针对性地干预相关通路可有效阻断疾病进程[17-21]。

综上所述，本课题组通过检索各大数据库现有的临床研究报道，建立了中医药治疗气滞血瘀型肝癌的处方数据库，借助中医传承辅助平台进行分析总结其用药规律，利用网络药理学的方法探索关键药物组合治疗肝癌的潜在机制。