基于数据挖掘和网络药理学探讨糖尿病合并缺血性脑卒中的用药规律及药物作用机制

郑金玲，石 岩，杨宇峰，姜永梅，孙红晓

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847；2.大连医科大学附属第二医院，辽宁 大连 116023；3.山东沂水县人民医院，山东 临沂 276400）

糖尿病是指以高血糖为特征的一类代谢性疾病，由胰岛素分泌不足或其作用障碍导致血糖升高引发[1]。缺血性脑卒中是指由于脑供血动脉（颈动脉和椎动脉）狭窄或闭塞，引起脑供血不足导致的脑组织坏死的总称。糖尿病患者机体长期的高血糖状态会导致动脉血管壁的损伤及血管内皮的脂质沉积，血管内皮杂质的沉积使管腔狭窄甚至闭塞，从而引起缺血性脑卒中[2-3]。脑卒中一旦发生，患者有很大发生二次栓塞的可能，有关缺血性脑卒中的流行病学调查表明，在1型糖尿病、2型糖尿病患者中，缺血性脑卒中的复发率分别为40.9%和29.7%[4]。一旦患病，会严重影响患者的生活质量及生活水平，给患者带来极大的生理、心理负担。据调查，中国脑卒中死亡年龄呈明显下降趋势，且高血糖为其中危险因素之一[5]。目前已经有研究证实，糖尿病患者的血糖水平与缺血性卒中发生风险呈正相关，即血糖水平越高，缺血性卒中发生风险越高[2]。目前西医对于脑卒中的治疗方法主要以阿司匹林等抗血小板聚集药为主，以及降糖、降脂、神经保护、纤溶酶治疗等方案[6-7]。虽然可以减少脑血管病的发生，但糖尿病患者合并缺血性脑卒中的发病率依然存在[8]。糖尿病合并缺血性脑卒中在中医学中属于“消渴”“中风”等范畴[9]。近年来，应用中医药治疗该病的患者越来越多并且在临床中取得了很好的疗效，但并没有应用数据挖掘方法分析其用药规律以及作用机制的研究[10]。本研究通过检索中医药治疗糖尿病合并缺血性脑卒中的临床研究，应用数据挖掘、分子对接方法探究中医药发挥药效的可能机制，为临床治疗糖尿病合并缺血性脑卒中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据选取 通过对中国知网、CBM、万方、维普等数据库进行检索，以“糖尿病合并缺血性脑卒中”“糖尿病”“缺血性脑卒中”“医案”“经验总结”“中药”“方剂”等作为主题词，检索起止时间为建库至2020年6月。选取应用中医药治疗糖尿病合并缺血性脑卒中的医案、病例分析、随机对照试验等，并由两名人员独立提取文献中所涉及的方剂。

1.2 纳入标准（1）符合糖尿病合并缺血性脑卒中的中西医诊断标准；（2）疗效标准参照《中药新药临床研究指导原则》[11]。

1.3 排除标准（1）综述、动物实验类文章；（2）干预措施不是中药口服汤剂；（3）四诊资料不全、用药配方不详、疗效不确定；（4）重复发表的文献。

1.4 数据挖掘方法

1.4.1 分析软件录入与核对 本研究经规范处理后由双人录入古今医案云平台V2.2.1软件，建立“中医药治疗糖尿病合并缺血性脑卒中的数据库”进行数据挖掘。在古今医案云平台首页，选择“医案数据采集”，点击“批量导入”。古今医案云平台配备专业中医药术语库，帮助用户进行数据智能规范化。同时支持用户手动修正标准化内容，并存储为标准医案库。利用“医案统计分析”中“医案标准化”功能，将本研究导入的“中医药治疗糖尿病合并缺血性脑卒中的数据库”中的疾病、证候、中药等数据进行标准化处理。

1.4.2 数据分析 本研究将标准化后的“中医药治疗糖尿病合并缺血性脑卒中的数据库”点击“批量加入分析池”按钮，全部加入分析池进行医案分析。利用古今医案云平台数据挖掘分析模块可对加入分析池的医案数据进行分析和挖掘，包括中药统计、中药配伍、四诊与中药、病证与中药、中药属性（四气、五味、归经、功效）、中药聚类分析等内容[12-13]。

1.4.3 复杂网络构建分析 使用Gephi-0.9.2软件实现网络的构建，通过不同的布局算法或者通过不同的统计方法对网络的总体特征、节点特征及节点与边的相关性等分析，供研究者发现网络中的规律。故本研究利用该软件，通过对网络拓扑性质进行计算和统计，以发现中医药治疗糖尿病合并缺血性脑卒中的核心方药。

1.5 网络药理学分析 通过中药系统药理学分析平台（TCMSP）网站[14]（http://tcmspw.com/tcmsp.php）获得糖尿病合并缺血性脑卒中核心药物所含的化学成分，将口服吸收率（OB≥30%）、类药性（DL≥0.18）作为筛选条件并获取相应靶点。通过TTD、DisGeNET、G eneCards等数据库以“Diabetes Mellitus Combined with Cerebral Infarction”为主题词获取疾病靶点。将疾病靶点与药物靶点取交集后，导入Cytoscape（3.6.0）软件构建“药物成分-靶点”网络图。利用RProject进行GO注释和KEGG通路富集分析[15]，进一步了解上述核心靶点的生物功能及在信号通路中的作用。

1.6 分子对接 通过RSCB PDB数据库（http://www.rcsb.org/）下载PDB格式文件，准备好核心靶点的3D结构文件。通过PubChem数据库下载核心化合物SDF格式的2D结构文件，应用Chem 3D软件转化为PDB格式。运用PyMOL软件对核心靶点进行去水、加氢等操作，利用AutoDock软件将化合物及靶蛋白格式转换为pdbqt格式，最后运行Vina进行对接。选取结合能较低且构象较好采用Discovery Studio、Pymol及Ligplus软件进一步分析展示对接结果。

2 结 果

2.1 中药频数统计 根据纳入、排除标准筛选后，共纳入74篇文献进行本次研究，包含中药方剂94首，涉及中药32味。对94首中药汤剂数据进行药物频数统计，频数≥25的中药共14味，频数排序前5位的分别为黄芪、川芎、当归、地龙、丹参。（见表1）

表1 中药使用频数表（频数≥25）

2.2 中药配伍关联分析 本研究使用关联规则分析，挖掘药物之间的关联关系，其中支持度表示同时包含A和B的事物占所有事物的比例。如果用P（A）表示使用A事物的比例，那么支持度=P（A∪B）。可信度表示使用包含A的事物中同时包含B事物的比例，即同时包含A和B的事物占包含A事物的比例，可信度=P（A∪B）/P（A）。提升度表示“包含A的事物中同时包含B事物的比例”与“包含B事物的比例”的比值。提升度=P（B|A）/P（B），提升度反映了关联规则中的A与B的相关性，提升度>1且越高表明正相关性越高，提升度<1且越低表明负相关性越高，提升度=1表明没有相关性。

将纳入方剂数据进行药物关联分析，经过筛选同现频数≥20，置信度≥0.8，支持度≥0.2，最终得到关联规则数据20条，其中排名前5的药物配伍为川芎-黄芪、当归-黄芪、地龙-黄芪、丹参-黄芪、地龙-川芎。（见表2）

表2 中药配伍关联分析表

续表2：

本研究对上述频数≥20共20个药对，运用Gephi进行药物归类可视化分析。源节点（Source）为药物A名称，目标节点（Target）为药物B名称，以此对数据进行预处理，如源节点为“当归”，则目标节点设置为“川芎”。将预处理后的数据导入Gephi软件，关系选为“边表格”，字符集选为“GB2312”，选取模块化处理，分别点击“平均度”“模块化”“特征向量中心度”及“网络直径”来计算网络的拓扑特征参数，选择Fruchteiman Reingold布局运行，并根据节点度来植染图中节点的大小，区值为10 000.0，重力值为10.0，速度为1.0进行可视化展示。（见图1）

图1 核心用药网络关系图

2.3 中药聚类分析 对药物频数排名前30的中药进行Ward法聚类分析。以距离≥7为界，可以将上述药物分为4组，第一组：黄芪、地龙、川芎；第二组：红花、桃仁、当归、赤芍；第三组：生地黄、五味子、天花粉、麦冬、白芍、茯苓、党参、炙甘草；第四组：水蛭、牛膝、石菖蒲、黄连、熟地黄、丹参、葛根、甘草、天麻、山萸肉、白术、山药、大黄、泽泻、南沙参。（见图2）

图2 中药聚类分析图

2.4 中药功效统计分析结果 对94首治疗糖尿病合并缺血性脑卒中的中药功效进行统计分析，得到使用频数较高的药物功效从高到低的频数排列结果，其中生津养血药使用频数最高86次。频数排序前5位的分别为生津养血药、清热凉血药、润肠通便药、利水消肿药、行滞通痹药。排序前10的中药功效频数排序数据见表3。

表3 中药功效频数表

3 核心配伍分子机制探讨

上述数据挖掘研究得出治疗糖尿病合并缺血性脑卒中的高频用药主要为黄芪、川芎、当归、地龙、丹参等，用药配伍关联规则分析、聚类结果提示“黄芪-川芎”的关联强度最高。所以“黄芪-川芎”为治疗糖尿病合并缺血性脑卒中的核心配伍用药，对其中的分子机制作进一步探讨。

3.1 “黄芪-川芎”的化合物成分收集 通过在TCMSP网站中检索“黄芪”“川芎”。将口服吸收率（OB≥30%）和类药性（DL≥0.18）作为筛选条件，得到黄芪化合物成分16个，靶点276个；川芎化合物成分7个，靶点75个。

3.2 疾病靶点收集 通过在TTD、DisGeNET、GeneCards数据库以“Diabetes Mellitus Combined with Cerebral Infarction”为主题词，分别检索得到23、1 189、3 082个疾病靶点，经查重共检索到3 353个糖尿病合并缺血性脑卒中的潜在作用靶点。

3.3 “黄芪-川芎”化合物成分-靶点网络构建 应用Cytoscape软件构建“黄芪-川芎”化合物成分-靶点网络图，图中共包含161个节点（2个中药、18个化合物成分、141个靶点）、294条边。其中橙色代表黄芪及其化合物、蓝色代表川芎及其化合物、红色为多靶点交叉的化合物、绿色代表疾病靶点。应用Network Analyze获取相关拓扑参数，首先选取节点度值（degree）的中位数为筛选标准，其次以介度（betweenness）和节点紧密度（closeness）的中位数作为筛选依据，共得到核心化合物成分17个、核心靶点53个。（见图3、表4）

图3 “黄芪-川芎”化合物成分-靶点网络图

表4 degree≥10 化合物成分与靶点表

续表4：

其中排名前5的化合物为槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、黄芪总皂苷（isorhamnetin）、芒柄花素（formononetin）、杨梅酮（myricanone），可能是“黄芪-川芎”发挥药效的成分之一。排名前5 的核心靶点为PTGS2、PTGS1、HSP90AA1、NOS2、RXRA，分别与15、11、10、8、8个化合物发生相互作用，可能是“黄芪-川芎”治疗糖尿病合并缺血性脑卒中发挥作用的靶点。3.4 基因GO与KEGG通路富集分析 利用R Project中的BiocManager、clusterProfiler等安装包，将上述53个核心靶点进行GO注释、KEGG通路富集分析。GO富集分析结果：生物过程（BP）P<0.05的条目有1 064个，细胞组成（CC）P<0.05的条目有29个，分子功能（MF）P<0.05的条目有71个。纵坐标为GO的名称，横坐标为富集在每一个GO的数目，颜色越趋近于红色代表P-Value越小，富集越高。（见图4）

图4 GD 富集分析barplot 图

KEGG通路富集分析结果：纵坐标为KEGG的名称，横坐标为富集在每一个KEGG的比例，圆圈的大小为富集的数目，颜色越趋近于红色代表P-Value越小，富集越高。主要涉及Endorine resistance、Platinum drug resistance、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450、Tryptophan metabolism、Drug metabolism-cytochrome P450、PPAR signaling pathway等信号通路。（见图5）

图5 KEGG 通路富集分析barplot 图

3.5 “黄芪-川芎”部分化合物作用于核心靶点的分子对接 本研究将degree排名前5的化合物成分及5个核心靶点PTGS2、PTGS1、HSP90AA1、NOS2、RXRA分别进行分子对接。（见表5）使用Autodock Vina和Pymol脚本完成高通量分子对接，一般认为配体与受体相互作用的亲和力越强，所需能量越少，其发生作用的可能性越大。分子对接的结果显示，这些化合物与核心靶点的结和能均低于-5.2 kcal/mol，表明亲和力较强。为了进一步研究配体与受体相互作用关系，采用Pymol对化合物小分子进行加氢、加电荷、删除水溶剂等处理，运用Discovery Studio 3.5 Client、Pymol、Ligplus软件对结合能排名前三的“化合物-蛋白”对接构象进行可视化展示，见图6～8。图中颜色越接近粉色亲水作用越强，反之越接近绿色疏水作用越强，图中应用Pymol展示空间结构、结合残基名称及其氢键，图Ligplus使用2D效果具体体现不用残基间的氢键距离，距离越短氢键的作用越强，结合的越紧密。

表5 degree 排名前5 的化合物与核心靶点对接结结合能表

图6 quercetin -PTGS2 分子对接图

图7 isorhamnetin-PTGS2 分子对接图

图8 kaempferol-PTGS2 分子对接图

4 讨 论

糖尿病合并缺血性脑卒中在中医学中属于“消渴”“中风”等范畴[16]，消渴病的病机主要为阴虚燥热，消渴病日久气阴两虚而致血脉运行无力形成血脉瘀滞，成为了中风发生的危险因素[17]。中医药治疗糖尿病合并缺血性脑卒中应以活血化瘀、益气养阴为主。目前，通过中医药治疗糖尿病合并缺血性脑卒中已经取得很好的疗效[18]，但至今没有关于其用药规律的统计分析，本次研究得出黄芪、川芎、当归、地龙、丹参、赤芍、生地黄、红花、葛根、桃仁、麦冬、水蛭、甘草、山萸肉等为治疗糖尿病合并缺血性脑卒中的高频使用药物，功效均以活血化瘀、益气养阴为主。药物关联分析发现川芎-黄芪、当归-黄芪、地龙-黄芪、丹参-黄芪、地龙-川芎等药物相互配伍频率较高，说明临床上常用黄芪配伍活血药治疗，起到补气活血的功用。本次研究在聚类分析中共得出4组药物，第一组：黄芪、地龙、川芎；第二组：红花、桃仁、当归、赤芍；第三组：生地黄、五味子、天花粉、麦冬、白芍、茯苓、党参、炙甘草；第四组：水蛭、牛膝、石菖蒲、黄连、熟地黄、丹参、葛根、甘草、天麻、山萸肉、白术、山药、大黄、泽泻、南沙参；4组药物主要功效均以行滞通痹、活血化瘀、益气养阴生津为主，与上述功效统计结果相一致。其中黄芪、川芎是本次研究中使用的高频药物，黄芪味甘、微温，是补中益气的要药，同时还具有利水消肿、固表止汗、托毒敛疮的功效，川芎味辛、性温，能够活血行气、祛风止痛，常用于治疗瘀血阻滞的各种病症。现代研究表明，吴英萍等[19]通过动物实验证实黄芪多糖可以通过调节TNF-α的水平，来改善胰岛素抵抗，降糖效果显著优于单用胰岛素。贾新菊等[20]通过研究发现黄芪甲苷可通过改善血管炎性病变，来降低糖尿病小鼠的血糖和糖化血红蛋白水平。周佳等[21]发现黄芪甲苷可下调脑组织中NF-κB蛋白表达,抑制氧化应激及炎症反应，从而有效减轻大鼠因脑缺血再灌注导致的神经功能缺损。方翔[22]发现川芎可通过影响神经胶质细胞Ube3aas基因水平治疗脑缺血小鼠。吴作敏等[23]亦认为“黄芪-川芎”药对可以通过调控多条通路治疗脑卒中。刘晓瑞等[24]应用益气活血法治疗糖尿病大鼠，可以改善大鼠脂代谢的紊乱，延缓糖尿病大血管病变的进展。

在“黄芪-川芎”-糖尿病合并缺血性脑卒中靶点网络图中筛选出53个核心靶点，其中排名前5靶点为PTGS2、PTGS1、HSP90AA1、NOS2、RXRA，说明在此网络中起到重要的作用。目前研究表明，PTGS1、PTGS2蛋白是前列腺素合成的主要限速酶，即前列腺素内过氧化物合酶1和环氧化酶2，其环氧化酶2是花生四烯酸代谢的起始限速酶-环氧化酶的同工酶[25]，王熠等[26]发现环氧化酶2的表达及活性增加参与了血管内皮胰岛素抵抗对内皮功能的影响。张如意等[27]认为糖尿病大血管病变的发生和发展可能与环氧化酶2 的激活有关。HSP90AA1是热休克家族蛋白的一种，在糖尿病发生发展过程中起到重要作用的分子伴侣蛋白家族[28]，王娇等[29]发现HSP90AA1可以有效延缓糖尿病并发症的进展。NOS2是一种诱导性一氧化氮合酶，NOS2的遗传多态性可能与糖尿病的易感性相关[30]。陆迪菲等[31]认为NOS是血管内皮功能重要的调节因子，通过多种机制参与心血管保护作用，能够有效抑制糖尿病大血管病变的发生和发展。RXRA是一种视黄酸受体，陈春莲等[32]发现视黄酸受体反应蛋白水平的升高可能与糖尿病大血管病变的发展有关，患者血浆视黄酸受体反应蛋白、CRP的水平与HbA1c、HOMA-IR的关系呈正相关。为中医药治疗糖尿病合并缺血性脑卒中提供了有效依据。

GO富集通路分析显示，“黄芪-川芎”-糖尿病合并缺血性脑卒中的主要环节是BP，如抑制氧化应激反应、调节活性氧代谢、炎症反应、对有毒物质、类固醇激素、抗生素、异种生物刺激、脂多糖等的响应，改善激素水平（包括类固醇激素、雌激素、性激素等）、调节细胞反应（药物、异源刺激、类固醇激素刺激等）。CC主要涉及核染色质、核染色体部分、神经细胞体、受体复合体、转录因子复合体、突触膜等部分。MF主要涉及酶结合（蛋白磷酸酶、磷酸酶、蛋白酶、细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂活性等），相关活性因子（类固醇激素受体活性、核受体活性、转录因子活性、丝氨酸水解酶活性、抗氧化活性等），蛋白结合（热激蛋白、肌动蛋白、Hsp90蛋白等）等各方面。KEGG富集通路分析显示，P-Value排序前20条的信号通路主要涉及PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、Endocrine resistance3条内分泌相关代谢通路，以及Ras signaling pathway、ErbB signaling pathway、FoxO signaling pathway、p53 signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、Chemokine signaling pathway、cAMP signaling pathway、Sphingolipid signaling pathway、Calcium signaling pathway、Rap1 signaling pathway等10条信号通路。目前研究发现，PI3K-AKT信号通路是胰岛素转导的重要信号通路，是调控血糖的重要通道[33]。朱百科等[34]发现川芎可通过介导PI3K-AKT信号通路，对脑缺血再灌注具有明显的保护作用。miR-145可通过靶向MAPK通路保护脑缺血性中风大鼠神经元干细胞[35]。李建设等[36]发现鼠李黄素可能通过抑制MAPK信号通路，修复糖尿病脑梗死大鼠脑组织损伤和炎症反应。陈丽莉[37]发现糖尿病大血管病变的发生有磷酸化p38MAPK的参与，干预p38MAPK信号转导通路能够延缓糖尿病大血管病变的发生、发展。赵海云等[38]通过临床研究发现自拟益气滋阴消瘀方可使患者血脂、同型半胱氨酸、纤维蛋白原降低，使患者神经功能提高，进而治疗T2DM合并脑梗死。

分子对接结果显示，槲皮素、黄芪总皂苷、山柰酚与PTGS2主要与135、45、47位甘氨酸，34位天冬酰胺，39位组氨酸等氨基酸残基发生氢键、疏水、范德华力等相互作用。

本次研究对中医药治疗糖尿病合并缺血性脑卒中进行用药规律分析，结果表明，高频应用药物为黄芪、川芎、当归、地龙、丹参、赤芍、生地黄等，以补气养阴、活血化瘀、行滞通痹为主要治法。网络药理学分析结果表明，结合分子对接技术将化合物与核心靶点进行结合能探测，进一步探究了“黄芪-川芎”治疗糖尿病合并缺血性脑卒中的可能作用机制，预测潜在作用靶点、通路及作用方式，体现了中药多成分、多靶点、协同作用的特点，为今后临床应用中医药治疗糖尿病合并缺血性脑卒中提供了研究方向及用药依据。