Pseudomonas stutzer S12过氧化氢酶基因的表达及酶学特性研究

赵书雪， 刘晓青， 伍宁丰， 田健

(1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定071000；2.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081)

生物体代谢会产生过氧化氢，过氧化氢酶(catalase，CAT)催化过氧化氢分解为水和氧气，几乎所有好氧生物体内都通过这一抗氧化反应来保护生物体机能[1]。过氧化氢酶由于其独特的抗氧化能力在生物[2]、医学[3]、临床[4]和食品[5]等方面具有广泛应用。另外，过氧化氢酶作为过氧化氢消毒的后处理工艺中的重要酶制剂，在机械消毒、纺织漂白[6]和废水处理[7]方面有着积极作用。此外，过氧化氢酶在畜牧[8]、乳品[9]、食品保鲜[10]等方面也有着广泛的应用。

商品过氧化氢酶主要来源于动物肝脏[11]和黑曲霉[12]。但是动物肝脏中的过氧化氢酶提取工艺复杂。黑曲霉过氧化氢酶一般通过黑曲霉自身发酵[13]产生，耐碱耐高温，但一般商业销售的黑曲霉过氧化氢酶的比活为100 U·mg-1，酶活力不高，且热稳定性不好。目前研究的过氧化氢酶多为中温酶，最适温度是30～50 ℃，比如葡萄球菌[14]、创伤弧菌[15]、地芽孢杆菌属[16]来源的过氧化氢酶等。中温酶在低温或常温条件下催化效率低，极大限制了其在食品、洗涤、低温环境修复等产业中的应用。对低温过氧化氢酶的研究并不多，且热稳定性不好，严重制约了其在生产实践中的应用，亟待改进。比如Lorentzen等[17]从嗜冷海洋细菌VibriosalmonicidaLFI1238中克隆的过氧化氢酶最适温度是0～10 ℃，60 ℃处理不到10 min失活；Zeng等[18]从SerratiamarcescensSYBC08分离的过氧化氢酶最适温度是20 ℃，在60 ℃处理45 min剩余酶活40%；王伟[19]从南极海洋微生物中分离的芽孢杆菌Bacillussp.N2a的过氧化氢酶的最适温度是25 ℃，在60 ℃处理30 min失活。因此，分离在低温下具有较高活力且热稳定性好的过氧化氢酶将能极大的提升其在工业生产中的应用。

垃圾渗滤液包含多种有害化学物质：溶解的有机物、无机盐、重金属及作为活性氧(reactive oxygen species，ROS)来源的异生物质有机化合物[20]，例如超氧化物，从而存在多种自由基物质，已经从中筛选到可以降解自由基的菌株，如假单胞菌[21]、拟杆菌属[22]、双酶梭状芽胞杆菌[23]等。而过氧化氢酶是降解自由基的重要酶之一[24]，且垃圾渗滤液属于城市污水，城市污水的温度多为15～25 ℃[25]，因此垃圾渗透液是筛选低温过氧化氢酶的理想来源。本研究从垃圾渗滤液中筛选出一株过氧化氢酶表达量较高的斯氏假单胞菌，并在大肠杆菌中表达其过氧化氢酶基因，酶学性质分析发现，该酶具有低温性质且热稳定性较好，为开发新型商品低温过氧化氢酶提供了新的材料，并为其在低温行业的应用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1菌株和质粒 垃圾渗滤液采自北京北神树卫生填埋场，从中筛选获得PseudomonasstutzeriS12菌株，pET30a(+)质粒载体为本实验室保存，E.coliTOP10克隆菌株、E.coliBL21(DE3)表达菌株购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2工具酶和试剂 限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自New England Biolabs (NEB) 公司；TaqDNA聚合酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司；DNA凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自Axygen生物技术有限公司；细菌基因组提取试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；BCA蛋白浓度定量试剂盒由江苏康为世纪生物科技有限公司提供；镍柱填料购自GE公司；30%过氧化氢购自阿拉丁试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯，购自北京化学试剂公司。

1.2 培养基和相关溶液

LB 培养基: 5 g·L-1酵母提取物，10 g·L-1蛋白胨，10 g·L-1NaCl，固体培养基含20 g·L-1琼脂，121 ℃灭菌20 min。

过氧化氢底物溶液：首先利用高锰酸钾滴定法[26]测定30%过氧化氢试剂摩尔浓度，然后用50 mmol·L-1pH 7.4磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液稀释到25 mmol·L-1，即为过氧化氢底物溶液。

1.3 实验仪器

PCR仪(Bio-rad公司)、紫外分光光度计(上海尤尼科科技有限公司)、超声破碎仪(美国Branson公司)。

1.4 试验方法

1.4.1过氧化氢酶高表达菌株初筛 将垃圾渗滤液用LB液体培养基稀释20倍，涂布在LB固体培养基，37 ℃培养14～18 h，此时菌株生长完好，从中筛选出26株菌落形态单一的菌株，用6%过氧化氢进行平板检测，观察菌株受到过氧化氢刺激而产生气泡的情况。

1.4.2高过氧化氢酶表达菌株复筛 从垃圾渗滤液中筛选到3个具有过氧化氢酶活性菌株，以1%的接种量接种到5 mL的LB液体培养基中，并对细胞进行超声破碎，分别测量菌液、发酵液上清、菌体破碎上清的酶活。

1.4.3过氧化氢酶基因克隆 将从垃圾渗滤液中筛选到的具有高过氧化氢酶活性的菌株送到北京奥维森基因科技有限公司进行基因组测序，经过全基因组序列分析获得该菌株过氧化氢酶基因katE序列信息。通过基因组提取试剂盒提取该菌株的基因组，并以该基因组为模板,用katE基因特异性引物(katE-F: cggatccATGACCGATA-AACCCAAATTGACG；katE-R: cctcgagGACCAGC-GCCTCCGCCAGG)扩增获得katE基因片段。 PCR反应体系50 μL：基因组 2 μL，2×TaqBuffer 25 μL，katE-F1 μL，katE-R1 μL，dNTP Mix (10 mmol·L-1) 1.0 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1.0 μL，ddH2O到50 μL。 扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，62 ℃(每个循环降低1 ℃)30 s，72 ℃ 1 min，14 个循环；95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32 个循环；72 ℃ 10 min。

1.4.4pET30a-katE重组质粒的构建katE基因扩增片段经BamH I和XhoI酶切后，连接到经同样酶切的pET30a(+)载体上，构建重组载体。将重组质粒pET30a-katE转化到E.coliTOP10克隆菌株，经菌液PCR方法挑选阳性克隆子并送北京擎科新业生物技术有限公司测序。序列在NCBI比对分析保守结构域。

1.4.5KatE过氧化氢酶的表达 从E.coliTop10菌株中提取重组质粒pET30a-katE并转化到E.coliBL21(DE3)表达菌株，添加终浓度为0.336 mmol·L-1IPTG，16 ℃、200 r·min-1诱导18～20 h， 4 ℃、8 000 r·min-1离心5 min，弃上清获得菌体，用20 mmol·L-1Tris-Cl重悬菌体，用超声破碎仪进行超声破碎，10 000 r·min-1离心30 min后取上清，通过镍柱纯化蛋白[27]。

1.4.6KatE过氧化氢酶活力测定 过氧化氢酶活力测定采用分光光度计方法[28]并适当改进。在试管中加入900 μL含25 mmol·L-1过氧化氢底物的50 mmol·L-1pH 7.4的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，35 ℃预热3 min，加入100 μL酶液，35 ℃反应3 min，加入1 mL的2 mol·L-1硫酸终止反应。在240 nm处检测过氧化氢的剩余量，过氧化氢的消光系数是43.6 L·mol-1·cm-1。

酶活(U)定义：1 min分解1 μmol过氧化氢需要的酶量。

1.4.7KatE酶学性质的测定 ①最适温度。 在50 mmol·L-1pH 7.4磷酸氢二钠-磷酸二氢钠底物缓冲液下，分别在10、20、30、35、40、50、60、70 ℃下测定KatE的过氧化氢酶活力。

②温度稳定性。分别将酶蛋白在50、60和70 ℃下处理1、2、3、4、5 h，然后在35 ℃、50 mmol·L-1pH 7.4磷酸氢二钠-磷酸二氢钠底物缓冲液下测定KatE的过氧化氢酶活力，以未处理的酶活计为100%，计算热处理后酶蛋白的相对酶活力。

③最适pH。在35 ℃条件下，分别在pH 5．0～6．0 (50 mmol·L-1磷酸氢二钠-柠檬酸)、pH 6．0～8．0 (50 mmol·L-1磷酸氢二钠-磷酸二氢钠)、pH 8．0 ～ 9．0 (50 mmol·L-1Tris-盐酸)、pH 9．0～10．0 (50 mmol·L-1甘氨酸-氢氧化钠)的底物缓冲液下测定KatE的过氧化氢酶活力。

④pH稳定性。将酶蛋白分别在pH 5．0～6．0 (50 mmol·L-1磷酸氢二钠-柠檬酸)、pH 6．0～8．0 (50 mmol·L-1磷酸氢二钠-磷酸二氢钠)，pH 8．0～9. 0 (50 mmol·L-1Tris-盐酸)、pH 9．0～10．0 (50 mmol·L-1甘氨酸-氢氧化钠)中4 ℃孵育1 h，然后在35 ℃、50 mmol·L-1pH 8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠底物缓冲液下测定KatE 的过氧化氢酶活力，以未处理的酶活计为100%，计算pH缓冲液处理后酶蛋白的相对酶活力。

⑤金属离子对酶活的影响。将0.03 mg·mL-1的酶分别在终浓度1 mmol·L-1的金属离子Li+、Na+、K+、Ni2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Ba2+、Co2+、Al3+中4 ℃孵育1 h，然后在35 ℃、50 mmol·L-1pH 8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠底物缓冲液下测定KatE的过氧化氢酶活力，以未处理的酶活计为100%，计算金属离子溶液处理后酶蛋白的相对酶活力。

⑥动力学参数。以不同浓度的过氧化氢(4.5、6、7.5、9、12、13.15、15、18、24 mmol·L-1)为底物，分别测定不同底物浓度下的过氧化氢的利用速率，采用双倒数作图法 (Lineweaver-Burk法)，求该酶的Km值和Vmax值。

2 结果与分析

2.1 高活力过氧化氢酶菌株的筛选

从垃圾渗滤液中筛选到26株细菌，经过平板检测发现3株菌产生气泡较多，具有过氧化氢酶活性。对这3株菌进行扩大培养并测量其菌液、发酵液上清、菌体破碎上清的过氧化氢酶酶活，发现1号菌株相对其他菌株具有更高过氧化氢酶酶活，且其过氧化氢酶在胞内表达，结果如图1所示。经过对1号菌株的16S rDNA分析，发现该菌株与假单胞菌属的序列相似性为99%以上，因此该菌株是假单胞菌属。之后结合全基因组分析发现该菌株的全基因组数据与斯氏假单胞菌相似性最高，因此可以判断该菌株属于斯氏假单胞菌，并命名该菌株为PseudomonasstutzeriS12。

图1 从垃圾渗滤液筛选的3个菌株的过氧化氢酶活力

2.2 过氧化氢酶基因katE的序列分析

对上述筛选得到的高过氧化氢酶活性的菌株P.stutzeriS12进行全基因组测序及分析，发现该基因组上具有1个编码过氧化氢酶的基因katE。该基因编码486个氨基酸和1个终止密码子，具有NADPH、血红素、四聚体结合位点，典型(单功能)血红素过氧化氢酶，属于过氧化氢酶中的小亚基酶。

2.3 重组过氧化氢酶KatE的诱导表达

将含有过氧化氢酶基因katE的重组质粒pET30a-katE转入到E.coliBL21(DE3)表达菌株，诱导表达并通过镍柱纯化获得目的蛋白，将纯化后的酶蛋白进行SDS-PAGE检测，如图2所示，纯化后的蛋白条带单一且条带大小和通过计算得到的62 kD相符合。

图2 KatE蛋白SDS-PAGE分析

2.4 KatE的酶学性质分析

2.4.1温度对KatE的酶学性质的影响 从图3可以看出， KatE的最适温度为35 ℃，且在10～40 ℃之间酶活力较平稳且高，40 ℃之后，酶活迅速下降，因此KatE在低温下酶活力较好。在60 ℃保温2 h后剩余酶活为50%左右，因此该酶热稳定性较好。

图3 温度对KatE活力的影响

2.4.2pH对KatE的酶学性质的硬性 在pH 5.0～12.0范围内对KatE的过氧化氢酶活力进行测定，结果图4所示，KatE的最适pH为8.0。且在35 ℃、pH 8.0时KatE酶比活可达到1 349 U·mg-1。将酶液于不同pH缓冲液处理1 h后测定酶的pH稳定性，该酶在pH 7～ 10剩余酶活均在90%以上，说明该酶在碱性条件下比较稳定，且最适pH 8.0下酶最稳定，因此该酶是碱性过氧化氢酶。

图4 pH对KatE活力的影响

2.4.3金属离子对KatE的过氧化氢酶活力的影响 测定不同金属离子对酶活力的影响，结果如图5所示，1 mmol·L-1Na+、Mg2+对该酶的活性有一定的促进作用，酶活分别提高2%、6%，Li+、K+、Ba2+对该酶的活性抑制作用不明显，Zn2+、Mn2+、Ca2+、Al3+对酶活有部分抑制作用，Ni2+、Cu2+、Co2+对酶的抑制作用最强，酶活均下降了99%。

图5 金属离子对KatE过氧化氢酶活力的作用

2.4.4KatE的动力学参数测定 通过双倒数作图法 (Lineweaver-Burk 法)计算该酶Vmax为16 666 μmol·L-1·min-1，Km为100.5 mmol·L-1，kcat为574.05 s-1。如图6所示，线性拟合较好，R2为0.993 2，因此该数据分析是准确的。

图6 动力学参数测定

3 讨论

斯氏假单胞菌P.stutzeri通常是生物安全级别较高的菌株，对其进行基因挖掘不仅对生物实验安全有益处，更为以后的产业化生产提供安全基础。目前对P.stutzeri的研究主要集中于对有机磷农药的降解[29]、反硝化作用[30]、固氮[31]、降解黄曲霉毒素的作用[32]，但是对于其抗氧化作用目前没有报道。而过氧化氢酶是生物抗氧化应激的细胞防御机制的重要组成部分，它可以将过氧化氢分解为氧气和水，具有良好地抗氧化作用[33]。过氧化氢酶在动物、植物、微生物中广泛存在，细菌、酵母、霉菌中都分离出来不少过氧化氢酶[34]。但是目前没有关于对斯氏假单胞菌的过氧化氢酶进行体外表达和性质的研究，因此本研究对该层面进行了探究，以此丰富了对斯氏假单胞菌的研究。

本研究从垃圾渗滤液中筛选出一株可表达过氧化氢酶的斯氏假单胞菌P.stutzeriS12，克隆了该菌株的过氧化氢酶katE基因，并对过氧化氢酶KatE的酶学性质进行了研究。结果表明，KatE最适温度是35 ℃，且在10～40 ℃酶比活较好，因此KatE是偏低温的中温酶。在50 ℃处理5 h，该酶酶活仍剩余70%左右，在60 ℃保温2 h剩余50%左右,其热稳定性优于一些中温酶。来自谷氨酸棒杆菌C.glutamicumATCC 13032的过氧化氢酶的最适温度为30 ℃，60 ℃保温30 min失活，剩余酶活10%[35]；来自藤黄微球菌M.luteus的过氧化氢酶在60 ℃孵育15 min，剩余酶活70%[36]；兼性嗜冷菌V.rumoiensiss-1T的过氧化氢酶的最适温度40 ℃，但是在65 ℃保温10 min后蛋白酶完全失活[36]；该酶的热稳定性还能与一些高温酶媲美，来自嗜热球形脲芽胞杆菌UreibacillusthermosphaericusFZSF03的过氧化氢酶最适温度为60 ℃，60 ℃热处理1 h，剩余酶活70%[37]；来自海洋的不动杆菌属Acinetobactersp. YS0810过氧化氢酶最适温度是60 ℃，在60 ℃保温30 min后剩余酶活78%[38]；与粘质沙雷氏菌性质相似的SerratiaSYBC-01 过氧化氢酶的最适温度70 ℃，60 ℃热处理1 h，剩余酶活70%[39]。此外，该酶的热稳定性明显优于商业过氧化氢酶，比如牛肝过氧化氢酶60 ℃热处理15 min后剩余酶活仅有 20%[36]，黑曲霉过氧化氢酶在60 ℃热处理1 h，剩余酶活40%多[40]。可见，本研究中过氧化氢酶KatE具有良好的热稳定性，有替代商品过氧化氢酶的潜力。此外，该酶在40 ℃之前的酶活力较高且稳定，因此该酶在低温条件下可能会有较好的应用潜力，对于食品低温保鲜[41]，全冷链行业中过氧化氢消毒的后处理有一定的作用。因此对katE基因的深入研究并寄希望于工业生产中实际应用是后面实验研究的重点。

金属离子对蛋白酶的酶比活影响的作用机制目前研究并不完善。本研究发现，大部分金属离子对KatE的过氧化氢酶活力的抑制作用不明显，Ni2+、Cu2+、Co2+对酶的抑制作用较为明显，而Na+、Mg2+对有一定的促进作用。由于KatE的最适pH是8.0，且在碱性条件下比较稳定，因此推测该酶是碱性蛋白酶。因此，Na+提高KatE的过氧化氢酶活性的机理可能是增强了蛋白酶的结构稳定性[42]，而Mg2+提高KatE的过氧化氢酶活性的机理可能是置换了KatE活性中心的金属离子。Co2+、Cu2+可能是与KatE发生反应，破坏了酶的空间结构，致使KatE失活，而Ni2+的抑制作用可能是氯化镍与磷酸盐发生反应生成络合物从而抑制KatE的酶活。因此在反应中适当地加入Na+、Mg2+可提高酶活力，并避免在体系中混有Co2+、Cu2+、Ni2+而抑制酶活。

在35 ℃、pH 8.0时KatE酶比活可达到1 349 U·mg-1，Vmax为16 666 μmol·L-1·min-1，Km为100.5 mmol·L-1,Kcat是574.05 s-1。而牛肝过氧化氢酶的Km是 49 mmol·L-1，Kcat是68 000 s-1[43]，黑曲霉过氧化氢酶的Vmax是1 500 μmol·mg-1·min-1，Km是27.73 mmol·L-1[33]，UreibacillusthermosphaericusFZSF03过氧化氢酶的Km是101.5 mmol·L-1[28], 因此可以发现，KatE相对于商品过氧化氢酶，对过氧化氢的亲和能力不高，对该蛋白进行改造以提高其对过氧化氢的亲和能力，提高催化效率是后续实验研究的重点。

本研究将来源于斯氏假单胞菌的过氧化氢酶进行了异源表达、纯化并对其酶学性质进行测定。结果表明，该过氧化氢酶具有较好的中低温环境适应性，热稳定性较好，在冷链消毒和食品保鲜方面有较好的应用前景。但该过氧化氢酶的过氧化氢的亲和能力不高，今后有望通过理性设计和定向进化等分子改造手段进一步提高过氧化氢酶的催化效率。