一种适合艾比湖条件的盐藻养殖体系的构建

辛乃宏，杨俊涛，李炳乾，陈庆亚，王新磊，赵喜荣，艾日肯江·库尔班江

(1.中盐工程技术研究院有限公司，天津 300450；2.精河县精河盐化有限责任公司，新疆 精河 833300)

盐藻(Dunaliellasalina)又称杜氏藻，为双鞭毛单细胞微藻。1838年，由法国生物学家Michel Felix Dunal在法国南部地中海沿岸蒙彼利埃(Montpellier)的盐池卤水中发现。1905年，Teodoresco[1]将此藻在杜氏藻属中做了分类描述，并定名“盐生杜氏藻”(D.salinaTeodoresco)。盐藻是已知的地球上最耐盐的光合真核生物，且具有广泛适盐和适温范围，海水(3% NaCl)到饱和卤水(31% NaCl)，耐受温度从低于0 ℃到大于38 ℃[2-3]。盐藻藻体内有一杯状色素体，可积累类胡萝卜素，以油滴的形式分布于叶绿体的周围，其β-胡萝卜素含量为自然界生物之首[3]，含量高达14%。盐藻类胡萝卜素由顺式和反式β-胡萝卜素的异构体构成[4]，一个典型的盐藻类胡萝卜素的组成为：15-cis-β-胡萝卜素占10%；9-cis-β-胡萝卜素占41%；全反式β-胡萝卜素占42%；其它异构体占6%[5-6]。盐藻中还可以积累大量的甘油[7]，含有不饱和脂肪酸、多糖等多种其它活性物质，盐藻在食品及水产饲料领域具有广泛的应用前景[8]。

国外对盐藻的研究长达100多年[9]。国外盐藻规模化养殖主要在澳大利亚和以色列，这两个国家采取不同的养殖模式，澳大利亚采用一种粗放式的养殖模式，这种模式利用西澳大利亚泻湖(HUTT LAGOON)的自然盐湖，建成大约每个养殖池5 hm2的盐藻养殖池，在大约25%的高盐度下养殖，养殖卤水取自盐湖，用海水调节养殖池的盐度，添加营养盐，靠自然的风力搅拌，养殖周期大约9个月[10-11]。以色列盐藻养殖采用的是半精养模式，跑道池养殖，搅拌桨搅拌，通入二氧化碳，这种模式养殖密度较高，生物量增殖可以达到2 g/m2·d，盐藻生物量可以达到0.3 g/L，盐藻粉胡萝卜素含量平均5%，盐藻产量和质量较为可控[12-13]。

我国的盐藻养殖从20世纪80年代开始，目前的规模化养殖面积较小，主要受到高盐度卤水条件和气候的限制[14-15]。新疆的高光照、少雨和高温等气候条件对于养殖盐藻生产β-胡萝卜素十分有利[16]。文章通过在新疆艾比湖使用盐田储卤池，利用当地独特的气候条件大面积养殖盐藻，拓展了国内盐藻的养殖区域，提高盐藻的养殖产量，降低盐藻的养殖成本。

1 材料与方法

1.1 藻种

盐藻藻种选自精河县精河盐化有限责任公司艾比湖盐田储卤池，经分离纯化获得纯盐藻藻种D.salina，编号为ZYXJA-1。该藻种用于试验的扩种及大面积养殖试验。

1.2 卤水

使用精河县精河盐化有限责任公司艾比湖盐田储卤池中卤水，盐度18 °Be′～22 °Be′。

1.3 盐藻扩种及养殖设施

1.3.1 室内扩种室

阳光温棚，内有能放置5 L三角瓶支架，内有长15 m，宽2.80 m， 深40 cm，面积42 m2的钢筋混凝土跑道池，配备搅拌桨。

1.3.2 室外一级扩种跑道池

室外一级扩种采用钢筋混凝土跑道池，长120 m，宽10 m，深40 cm，面积1 200 m2，配备搅拌桨。

1.3.3 室外二级扩种跑道池

室外二级扩种采用土池简易跑道池，长250 m，宽60 m，面积15 000 m2，池底采用细小碎石铺底，碎石护坡，配备搅拌桨。

1.3.4 大面积养殖池

使用精河县精河盐化有限责任公司8号储卤库，该储卤库南北长400 m，东西宽250 m，面积100 000 m2，池底采用细小碎石铺底，碎石护坡。

1.4 盐藻藻种的扩培

1.4.1 三角瓶藻种一级扩培

在5 L三角瓶中加入体积3 000 mL 20 °Be′的卤水，使用高压灭菌锅120 ℃灭菌20 min，冷却至室温后加入营养盐，按照约3万细胞/mL的密度接入盐藻藻种ZYXJA-1。接种后的三角瓶置于室内扩种室的支架上，每天上下午各摇动一次，观察盐藻的生长状况。

1.4.2 室内跑道池二级扩培

在面积42 m2的跑道池中加入20 cm水深、20 °Be′经蒸汽消毒的卤水，待水温降至室温后，加入营养盐，接入不少于50瓶的5 L三角瓶密度大约50万细胞/mL的盐藻，白天定时开启搅拌装置，每天检测盐藻密度及杂藻情况。

1.4.3 室外跑道池一级扩培

在面积1 200 m2的室外跑道池中加入水深20 cm、20 °Be′的卤水，加入营养盐，开启搅拌装置，缓慢加入50 mg/kg有效氯10%的次氯酸钠溶液，搅匀后静置24 h，取样观察有无活的杂藻及敌害生物。检测无余氯后，接入3个室内跑道池的藻种，接种密度控制在3万细胞/mL以上。白天定时开启搅拌装置，每天检测盐藻密度及杂藻情况。控制养殖水体在18 °Be′～23 °Be′。

1.4.4 室外跑道池二级扩培

在面积15 000 m2的室外二级扩种跑道池中加入20 °Be′的卤水，加入营养盐，开启搅拌装置，缓慢加入50 mg/kg有效氯10%的次氯酸钠溶液，搅匀后静置24 h，取样观察有无活的杂藻及敌害生物。检测无余氯后，接入1个室外一级跑道池的藻种，接种密度控制在3万细胞/ml以上。白天定时开启搅拌装置，每天检测盐藻密度及杂藻情况。控制养殖水体在20 °Be′～23 °Be′。

1.4.5 室外大面积养殖

在100 000 m2储卤池中加入水深20 cm，20 °Be′的卤水，加入营养盐，在有风时的上风口接入15 000 m2的室外二级扩种跑道池中的盐藻种，接种密度控制在3万细胞/mL以上。依靠该地区的自然风力搅拌，控制养殖水体浓度22 °Be′～24 °Be′。每天检测盐藻的密度和杂藻的密度，定期测定水体中的胡萝卜素含量。

1.5 盐藻及水体中胡萝卜素的检测方法

1.5.1 盐藻密度检测方法

盐藻密度计算采用微生物显微计数——血球计数板法。

1.5.2 盐藻养殖水体中胡萝卜素含量检测方法

取5 mL待检测水体置于比色管中，向比色管中加入3 mL～5 mL 90%的丙酮溶液，充分振荡后静置分层；待上层萃取液颜色不变后，用吸管吸取到另一25 mL比色管中；重复上述步骤，直至萃取无色；将萃取液用90%丙酮稀释至25 ml刻度线，用分光光度计(波长450 nm)测量吸光度A值。水体胡萝卜素浓度计算公式为：

βC=20A

(1)

式中：βC——水体中胡萝卜素含量，mg/L；A——吸光度。

2 结果与分析

2.1 大面积盐藻养殖扩养体系的建立

试验通过建立2级室内扩种(5 L三角瓶、42 m2跑道池)和三级室外盐藻扩培(1 200 m2室外跑道池、15 000 m2室外跑道池、100 000 m2储卤池)的盐藻扩养体系(图1)，较好地保证每一级盐藻扩种的接种密度，有效地控制大面积养殖池杂藻竞争问题。

图1 大面积盐藻养殖扩培体系Fig.1 Large scale culture system of Dunaliella Salina

2.2 盐藻生长情况

2.2.1 室内跑道池盐藻生长情况

盐藻ZYXJA-1在2017-09-28从5 L三角瓶接种到3号育种室的跑道池，密度1万细胞/mL，至2017-11-20由于室温维持在10 ℃以上，盐藻生长较快，密度达到33万细胞/mL。2017-11～2018-03，由于气温长期维持在10 ℃以下，有时甚至0 ℃以下，盐藻生长缓慢，盐藻密度维持在30万细胞/mL～38万细胞/mL之间。2018-03中旬，由于气温回升，盐藻开始生长，至2018-03-18盐藻密度达到42万细胞/mL。此育种室的盐藻作为1号育种室和2号育种室的盐藻种源，进行盐藻的扩种。

2018-03，将3号育种室的盐藻接到2号育种室的跑道池中，2号育种池的接种密度为20万细胞/mL，扩种期间2号育种室的室温维持在14 ℃～21 ℃之间，盐藻实现较快的生长，12 d养殖周期，盐藻由20万细胞/mL增至80万细胞/mL。镜检在育种室跑道池中未发现杂藻。

2.2.2 室外一级扩种跑道池盐藻生长情况

2018-04-20，将1号～3号育种室的盐藻接到1号和2号室外1 200 m2跑道池。1号和2号室外1 200 m2跑道池盐藻生长及气温变化见图2。

图2 盐藻在1 200 m2跑道池内的生长情况Fig.2 Growth of Dunaliella Salina in 1 200 m2 runway pool

1号池接种密度为5万细胞/mL，2号保种池接种密度为4万细胞/mL。在21 d养殖周期内气温在15 ℃～25 ℃之间，盐藻实现了较快的生长，1号池密度达到了83万细胞/mL，2号池密度达到了80万细胞/mL。在养殖的第7 d镜检发现杂藻，1号池杂藻密度1万细胞/mL，2号池杂藻密度2万细胞/mL。至养殖周期结束，2个跑道池的杂藻始终控制在5万细胞/mL。

2.2.3 室外二级扩种盐藻生长情况

2018-05-10，将室外1级扩种池的盐藻接种到室外二级扩种池(面积15 000 m2)，接种密度5万细胞/mL。盐藻生长及气温变化见图3，在33 d的养殖周期内，气温变化在16 ℃～35 ℃之间，盐藻由5万细胞/mL增长到52万细胞/mL。在养殖第8 d镜检发现杂藻，从最初的1万细胞/mL，到第16 d的9万细胞/mL，以后始终维持在7万细胞/mL～8万细胞/mL。

图3 盐藻ZYXJA-1在15 000 m2扩种池中生长情况Fig.3 Growth of Dunaliella Salina ZYXJA-1 in 15 000 m2 expansion tank

2.2.4 储卤池盐藻生长情况

2018-06-12，将室外二级扩种池的盐藻接到100 000 m2的储卤池中，接种密度4万细胞/mL。盐藻生长及气温变化见图4。

图4 盐藻在储卤池(100 000 m2)中的生长情况Fig.4 Growth of Dunaliella Salina in brine storage tank (100 000 m2)

期间气温在28 ℃～35 ℃之间，盐藻由最初的4万细胞/mL，9 d后快速增长到16万细胞/mL，再缓慢增长至24万细胞/mL。前9 d的养殖周期内，杂藻始终控制在1万细胞/mL，最后杂藻增长至4万细胞/mL。

在储卤池养殖的第19 d、第21 d、第22 d、第24 d分别测定水体中胡萝卜素的含量，其含量分别为8.5 mg/L、9.16 mg/L、9.22 mg/L、9.78 mg/L。

3 讨论

3.1 大面积盐藻养殖扩养体系

盐藻养殖过程中极易受到一种称为小绿盐藻(D.viridis)的杂藻污染，绿盐藻细胞内胡萝卜素含量很低，在盐藻养殖过程中绿盐藻大量繁殖会影响盐藻D.salina的生长，使盐藻粉中胡萝卜素含量降低[17]。此研究建立的体系通过2级室内保扩种保证了盐藻种的纯度，避免了杂藻的污染，同时保证了接种到室外扩种的接种量。利用扩种和养殖阶段分开和添加不同营养盐的养殖模式，实现了盐藻的分段培养模式，可以提高盐藻种胡萝卜素的含量[18]。

3.2 室内扩种情况

通过延续一个冬季的扩种实验证明盐藻ZYXJA-1在气温15 ℃以上就可以实现快速生长，在低至零下2 ℃情况下藻种依然可以安全越冬。在育种池中盐藻密度可使用扩种的营养盐配方和较高的接种密度，盐藻密度可以快速达到80万细胞/mL。室内密闭的空间和高温灭菌卤水保证了扩种盐藻的纯度，整个室内扩种实验期间未发现杂藻污染。

3.3 室外扩种情况

由于室外一级扩种池较小的水体和较好的搅拌设施，盐藻密度可以增长到80万细胞/mL。由于受到露天条件的限制，在扩种过程中发现了杂藻的污染，但始终维持在可控的水平内，杂藻比例小于6%。在二级室外扩种池中，由于养殖水体的扩大，盐藻密度的最高密度达到50万细胞/mL，杂藻控制难度也相应加大。

3.4 储卤池盐藻养殖情况

盐藻大面积养殖特别是100 000 m2单体养殖无搅拌装置，在营养盐添加、盐度调节及杂藻控制等都具有较大难度，目前最大盐藻养殖单体是澳大利亚泻湖(Hutt Lagoon)，单体养殖面积50 000 m2。由于储卤池中的添加的营养为有利于积累胡萝卜素的配方，盐藻生长前期相对较快，后期相对缓慢，第1 d至第9 d盐藻密度达到16万细胞/mL，第10 d至第24 d盐藻密度由16万细胞/mL仅增长到22万细胞/mL。

从胡萝卜素的积累来看，第19 d、第21 d、第22 d、第24 d的胡萝卜素含量分别为8.5 mg/L、9.16 mg/L、9.22 mg/L、9.78 mg/L，对应到单个细胞的胡萝卜素含量分别为53.1 pg、48.2 pg、46.1 pg、44.5 pg，对单个细胞的胡萝卜素积累来说，应该是一个比较高的数值，其含量远远大于王富平等[19]在塘沽气候条件下取得的单体细胞11.4 pg的结果，优于Ben-Amotz[20]报道的最佳光照条件下单个盐藻细胞胡萝卜素含量积累40 pg的结果。从单位时间面积胡萝卜素的积累量来看，第19 d、第21 d、第22 d、第24 d分别为0.089 m2·d、0.087 m2·d、0.084 m2·d、0.082 m2·d，这一数值略低于以具有搅拌措施和二氧化碳添加的以色列跑道池盐藻养殖胡萝卜素的积累1 m2·d的积累量[20]，但作为一种盐藻的粗养模式，其积累完全可以接受的结果。

4 结论

新疆艾比湖气候条件完全适合盐藻的大面积培养，养殖周期每年从四月至十月中旬，达到6个月以上，远远大于国内其它地区的养殖周期。新疆艾比湖其较强的日照和多风的天气，使盐藻养殖密度和胡萝卜素积累都优于国内其它地区的盐藻养殖。利用盐田季节性闲置的储卤池可以降低建造盐藻养殖设施的基础投资，可以显著降低盐藻的生产成本。