甘青青兰化学成分分析现状及挥发性成分HS-SPME-GC-MS测定*

白玛央宗 玉珠拉姆 白玛拉珍 马超**

（1.西藏自治区高原生物研究所；2.西藏职业技术学院，西藏 拉萨 850000）

甘青青兰(Dracocephalum tanguticum)又名唐古特青兰，是唇形科多年生草本植物，主要分布在青藏高原及其毗邻区域，在西藏地区广泛分布，常在干燥河谷的河岸、田野、草滩或松林边缘生长，海拔1900～4000m［1,2］，实际分布海拔大于4000m。甘青青兰作为常用药材广泛应用于藏药中，300 多种常用藏药复方或制剂中将近三分之二包含甘青青兰［3］。同时，因具有特殊的香味，在西藏地区也作为民间常用植物香料。

据文献记载，甘青青兰的化学成分主要有黄酮类、萜类、多糖及挥发油等，其中黄酮类化合物主要包括：胡麻苷、茵芋苷、大波斯菊苷、(R,S)-芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、5,3',4'-三羟基-6,7-二甲氧基黄酮、5,6,4'-三羟基-7-甲氧基黄酮、5,4'-二羟基-6,7-二甲氧基黄酮-4'-O-β-D-葡萄糖苷、5,7,4'-三羟基-3',5'-二甲氧基黄酮、条叶蓟素-4-葡萄糖、胡麻苷-6'-乙酸酯、β-胡萝卜苷等［4-6］，王敏等对其提取工艺进行了优化［7］；萜类化合物主要包括：齐墩果酸及其衍生物、熊果酸及其衍生物、羽扇豆烷及其衍生物、白桦酯醇、α-香树脂醇、乌发醇、齐墩果烷等［2-3］；酯类邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸-双(2-乙基庚)酯等［8］；苯丙素类绿原酸甲酯及2,3-2H-3-羟基-咖啡酸甲酯［9］；酚酸类迷迭香酸及其酯化物［10］，同时还含有丰富的多糖［11-12］及挥发油［13-14］等。

甘青青兰作为常用藏药材，传统上用花期地上部分，为更好的研究甘青青兰挥发性熏香组分，笔者对花期采集于西藏自治区日喀则市康马县的甘青青兰（平均海拔4300m），采用顶空-固相微萃取挥发性组分并用气相色谱-质谱分析测定（HS-SPME-GC-MS）其挥发性组分。同时，对样品建立以ITS2和rbcL的分子标记，为甘青青兰资源的深度开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2018 年8 月，笔者赴西藏自治区日喀则市康马县采集甘肃青兰，为盛花期甘青青兰地上部分，样品阴干处理（西藏日喀则宏康扶贫开发有限公司组织当地村民采集），由西藏自治区高原生物研究所马超副研究员鉴定。

1.2 仪器与试剂

GC-MS安捷伦7890A-7000C；高速万能粉碎机天津市泰斯特仪器FW100；磁力搅拌器北京大龙MSH-Pro；微固相萃取Supelco 50/30um,DVB/CAR/PDMS；万分一天平SARTORIUS MSE224S；振荡器上海比郎TYXH-I；植物DNA提取试剂盒索莱宝。

1.3 实验方法

1.3.1 HS-SPME 条件。取2.0g 样品加入到50mL 顶空瓶中，加入10mL 煮沸蒸馏水，立即密封顶空瓶。将样品瓶置于60℃水浴中平衡15min，插入装有纤维头的手动进样器，萃取40min 后，取出萃取头插入GC 进样口中于250℃解吸附3min，拔出萃取头的同时启动仪器收集数据。萃取头：50/30 DVB/CAR/PDMS 萃取头。

1.3.2 DNA 提取及引物信息。取0.2g 粉碎样品在液氮中磨细后采用天根植物DNA提取试剂盒进行提取，采用引物（表1）为分别扩增ITS2 及rbcL 片段，由北京美吉生物医药科技股份有限公司测序，结果在NCBI数据库检索。

表1 甘青青兰DNA扩增引物信息

1.3.3 GC-MS条件

1.3.3.1 气相色谱（GC）条件：HP-5MS（60m×0.32mm×0.25μm）石英毛细管柱；进样口温度250℃，载气为高纯氦气＞99.999%，流速1.0mL/min；无分流进样；色谱柱升温程序：初始温度50℃，保持2min，以5℃/min 升至250℃，保持3min，以10℃/min 升至300℃，运行时间为50 min。

1.3.3.2 质谱条件：离子源为EI 源，离子源温度250℃，电离能量70eV；四极杆温度150℃；接口温度280℃；质量扫描m/z为40～600。通过Nist11标准质谱图库检索，采用峰面积归一化法进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 形态及分子生物学鉴定

将测得的样品序列在NCBI数据库上进行Blast比对，显示其ITS2 序列相似度最高（96%）的为青兰属百花栀子花（KF041167.1），而rbcL 序列相似度最高（99%）的为甘青青兰（MT457746.1），结合样品形态鉴定确定样品为甘青青兰。两段序列已上传至Gen‐Bank，登录号分别为MW889005、MW915538。

2.2 挥发性成分检测

采用HS-SPME-GC-MS 提取分析甘青青兰挥发性成分，将样品谱图与NIST 指纹库进行比对,一共鉴定出了93 种化合物（表2）。经过面积归一化分析,所有鉴定出来的化合物占所有色谱峰总面积的99.52%.主要挥发性成分为反-松香芹乙酯（12.20%）、罗勒烯（12.18%）、N［（1S,2S）-2-氨基环己基］-N’-［3,5-双（三氟甲基）苯基］-硫脲（4.95%）、（4R，5S）-5-乙烯基-5-甲基-4-（1-甲基乙烯基）-2-（1-甲基亚乙基）-环己酮（4.45%）、月桂烯（3.38%）、欖［香］醇（3.12%）等。

表2 甘青青兰挥发性成分及其相对含量

表2 （续）

表2 （续）

表2 （续）

2.3 主要挥发性成分含量对比

王钢力［15］、利毛才让［13］、徐中海［3］、黄小平［14］对产区为青海、青海、西藏、四川的甘青青兰，采用水蒸气蒸馏法提取挥发性组分，并用GC-MS 及峰面积归一化法测定相对含量。将以上四个样品与康马县样品的8 种主要成分及其含量对比（表3），发现康马县采集的甘青青兰中有含量较高的反-松香芹乙酯和罗勒烯，王钢力的样品含有高含量的桉油精和N-乙基对甲苯胺，利毛才让的样品中发现极高含量的反-松香芹乙酯，其中罗勒烯、N-乙基对甲苯胺并未在其他样品中测得，该结果显示在样品的化学组成和其含量上，不同地区样品间存在较大的差异。

表3 不同产地甘青青兰的主要挥发性成分含量对比

3 讨论

甘青青兰广泛应用于藏药中，根据文献发现不同地区甘青青兰采用水蒸气蒸馏法提取的挥发性成分含量存在较大的差异，对比西藏花期甘青青兰采用固相微萃取提取挥发性组分通过GC/MS 分析发现桉油精均被检测到，α-蒎烯、月桂烯、T-杜松醇、反-松香芹乙酯也有较高的检出率，但几种物质在含量上存在较大差异，鉴于植物的采集时期（苗期或花期）、处理和贮存方法和时间的差异，同时还有地域的区别，都可能导致最终检测结果的差异。药材是一种特殊的商品，在其质量上应具有化学成分的同一性。尽管在藏药材质量标准上进行了大量的基础研究，仍存在用药部位不清，质量标准适用宽泛且简单等的问题［16-17］，甘青青兰作为藏医药常用药材，在用药上还需统一认识，确定其药用部位，建议从采集加工源头上规范采集，统一标准，同时开展不同地区协同研究，进行该药材的道地性评价。