室内外培养对大溪地等鞭金藻细胞生长和色素含量的影响

吕布 ，叶丙聪 ，周建聪 ，李曦 ，王爱民 ，顾志峰 *，郑兴

（1.海南大学海洋学院，海南 海口 570228；2.海南大学南海海洋资源利用国家重点实验室，海南 海口 570228）

大溪地等鞭金藻（Isochrysis galbana）是一种微小的金黄色金藻，其个体较小（直径5 μm），且无细胞壁，其营养物质丰富，富含多种不饱和脂肪酸和蛋白质，并具有易被消化吸收等特点[1]。大溪地等鞭金藻作为海产双壳动物幼虫的理想饵料，已广泛应用于大珠母贝、扇贝、牡蛎和泥蚶等养殖，并被认为是人工育苗的优质饵料[2-5]。在细巧华哲水蚤人工规模培养中，大溪地等鞭金藻也是其较优饵料[6]。

大溪地等鞭金藻是微藻的一种，微藻中光合色素主要包括叶绿素和类胡萝卜素，其具有吸收和传递光能的功能[7]，是细胞光合作用的主要参与者。光合色素的含量对微藻的碳、氮代谢十分重要，可直接影响微藻的生长发育及产量[8]。在微藻的培养中，培养条件影响着微藻的生长速度、高效扩繁及活性物质的积累[9]。养殖户在室内培养微藻的过程中，由于空间有限，影响其生长和繁育，同时室内培养需要光照，在此过程中消耗大量的电力，因此，调整培养模式和条件对微藻的培育十分重要[10]。目前，室外条件下规模培养微藻具有极大的应用价值[11]。掌握微藻的生长规律及最优培养条件，对于提升微藻生长速度和扩大产量有较大意义[12]。现将大溪地等鞭金藻于室内和室外条件下开展培养试验，对比分析其生长规律、光合色素含量、水分含量及灰分含量的差异，以探究最适培养条件，为大溪地等鞭金藻的开发利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

大溪地等鞭金藻取自海南大学海洋学院保种室。试验前对藻种进行纯化扩培，提取快速生长期的藻液。使用过滤并灭菌的自然海水及“宁波3#”微藻培养液，海水的盐度为30，培养基成分为ρ（NaNO3）=100 mg/L，ρ（NaH2PO4）=10 mg/L，ρ（FeSO4）=2.5 mg/L，ρ（MnSO4）=2.5 mg/L，ρ（EDTA－Na）=10 mg/L，ρ（维生素 B1）=6×10-3mg/L，ρ（维生素B12）=5×10-7mg/L[4]。

1.2 试验方法

包括室内和室外两种培养条件。其中室内试验培养条件：温度为（25±1）℃，光照强度为（119±1）μmol/（m2·s），光暗周期为12 h∶12 h；室外试验培养条件：温度为（22±3）℃，光照强度为（442±94）μmol/（m2·s），光暗周期为12 h∶12 h。每种条件设置3 个平行培养组，于5 L 三角锥形瓶中进行培养，藻细胞接种密度为1.00×103cells/L，培养过程中不充气，每天摇动几次。以藻种与培养液充分混合后为时间起点，每隔24 h 取样1 次，取样前将培养瓶中的藻液摇匀，分别取3 个样品检测藻类密度、干重、湿重、灰分和色素含量。

1.3 测定项目及方法

（1）藻细胞数目。采用血球计数板法测定[13]。

（2）藻细胞干重。烘干并预先称量Whatman GF/C 膜的质量，将20 mL 大溪地等鞭金藻的藻液于该膜过滤，经过冲洗除营养盐后，放入105 ℃烘箱中烘72 h 后称取质量，以前后两次质量差不超过2 mg为准，通过烘干前后质量的差值来计算干重[14]。

（3）水分含量。培养结束后，将20 mL 藻液通过Whatman GF/C 膜抽滤，于105 ℃烘箱中干燥至恒重，称取质量，直至前后两次质量差不超过2 mg，干燥后的质量记为m1。同时，取20 mL 藻液4 000 r/min，离心10 min，收集藻细胞，样品的质量记为m2[14]。

（4）灰分含量。将Whatman GF/C 膜放在铝箔杯中，置于105 ℃的烘箱中，烘干至恒重，记为M2；将20 mL 藻液通过Whatman GF/C 膜抽滤后，放入铝箔杯于500 ℃的马弗炉中烘干至恒重，记为M3。铝箔杯的质量记为M1[15]。

（5）叶绿素及类胡萝卜素的测定。利用丙酮萃取法提取微藻的叶绿素[16-17]，将藻液于Whatman GF/C 膜上抽滤，离心，用分光光度计（岛津UV-1700）分别测定在波长为 630，647，664，750 和 470 nm 处溶液的吸光度值并记录，减去波长750 nm 下测得的吸光度值，得到校正后的各波长对应的吸光光度值，并计算各色素的浓度。

1.4 数据分析

试验数据均表示为平均值±标准差（Mean±SD），采用Microsoft Excel 2016 对数据处理，用DPS 14.5软件进行单因素方差分析，若有显著差异，再进行二因素方差分析，以P<0.05 为差异显著。

2 结果和分析

2.1 两种培养条件对密度的影响

试验结果显示，在室内培养条件下，培养1~7 d，藻细胞密度随培养时间的延长而升高；在室外培养条件下，培养1~10 d，藻细胞密度随培养时间的延长而升高；达到峰值后，两种培养条件下的藻细胞密度均随培养时间的延长而逐渐降低并趋于平稳。在室外培养条件下，藻细胞密度在第10 d 最高，为4.95×103cells/L，在室内培养条件下，藻类密度在第7 d 最高，为3.48×103cells/L（图1）。第8 d 开始，两种培养条件下藻类细胞密度开始出现显著差异（P<0.05），二因素方差分析结果显示，室外培养条件下藻细胞密度显著（P<0.05）高于室内培养条件下。

图1 两种培养条件对大溪地等鞭金藻密度的影响

2.2 两种培养条件对色素含量的影响

试验结果显示，在室内培养条件下，叶绿素a、叶绿素c 和类胡萝卜素经过缓慢增长后快速达到最高浓度，然后逐渐降低：叶绿素a 在第7 d 达到最大质量浓度，为0.44 mg/L；叶绿素c 在第2 d 达到最大质量浓度，为 0.26 mg/L（图2）；类胡萝卜素在第7 d 达到最大质量浓度，为5.91 mg/L（图3）。在室外培养条件下，叶绿素a、叶绿素c 和类胡萝卜素的变化趋势与室内条件类似：叶绿素a 在第11 d 达到最大质量浓度，为 0.78 mg/L；叶绿素c 在第11 d 达到最大质量浓度，为0.28 mg/L；类胡萝卜素在第11 d达到最大质量浓度，为14.15 mg/L。

图2 两种培养条件对大溪地等鞭金藻叶绿素的影响

图3 两种培养条件对大溪地等鞭金藻类胡萝卜素的影响

两种培养条件下，叶绿素a 质量浓度从第4 d开始出现极显著差异（P<0.01），叶绿素c 质量浓度从第11 d 起开始出现极显著差异（P<0.01），类胡萝卜素质量浓度从第3 d 开始出现极显著差异（P<0.01）。二因素方差分析表明，不同培养条件对于叶绿素a 具有极显著的影响（P<0.01），而培养时间无显著影响（P>0.05）；不同培养条件和时间对叶绿素c 均具有显著的影响（P<0.05）；不同培养条件对于类胡萝卜素具有极显著的影响（P<0.01），而培养时间无显著影响（P>0.05）。在室外培养条件下，叶绿素a 和类胡萝卜素质量浓度均显著（P<0.05）高于室内培养条件。

2.3 两种培养条件对水分和灰分含量的影响

试验结果显示，大溪地等鞭金藻水分含量和灰分含量的变化趋势相似，其中在室内培养条件下，大溪地等鞭金藻水分含量最大值为95.11%，灰分含量最大值为70.57%；在室外培养条件下，水分含量最大值为95.53%，灰分含量最大值为82.57%；在两种培养条件下灰分含量具有显著性差异（P<0.05）（图4 和图5）。二因素方差分析结果显示，培养时间对大溪地等鞭金藻的水分含量和灰分含量具有极显著的影响（P<0.01），不同培养条件对大溪地等鞭金藻的水分含量无显著影响（P>0.05），对于灰分含量有显著的影响（P<0.05）。

图4 两种培养条件对大溪地等鞭金藻水分含量的影响

图5 两种培养条件对大溪地等鞭金藻灰分含量的影响

2.4 两种培养条件对培养基pH 值的影响

试验结果显示，在室内培养条件下培养基的pH 值为7.1~8.7，在室外培养条件下培养基的pH值为9~9.6，其中在室外条件下培养基pH 值升高的幅度较大（图6）。从第3 d 开始，在两种培养条件下培养基pH 值开始出现显著差异（P<0.05）。二因素方差分析结果显示，培养时间对培养基pH 值无显著影响（P>0.05），培养条件对培养基pH 值有极显著的影响（P<0.01）。

图6 两种培养条件对大溪地等鞭金藻培养基pH 值的影响

3 讨论

研究显示，与室内严格的培养条件相比，室外培养条件的变化大，具有不确定性，室外培养条件对微藻细胞的适应能力提出了更高的要求。由于室内外的环境不同，导致培养条件和污染程度各不相同，藻细胞在生长方面也表现出了不同的规律。在室外培养条件下，藻细胞的生长环境较室内恶劣，尽管在室外培养条件下培养基的pH 值变化较小，但是与室内条件下存在极显著差异（P<0.01），且室外温度的变化也较明显。室外培养条件下藻细胞密度显著（P<0.05）高于室内培养条件。柳敏海等[4]研究显示，大溪地金藻适宜生长温度为10~35 ℃，其适合作为在高温季节的育苗饵料。在室外培养条件下，培养中的部分藻细胞密度有所下降，可能与当天降雨温度和光照变化相关。本研究中，随着培养时间的延长，培养液中积累的有机成分增多，藻液更有利于杂藻和细菌的生长，其种类和数量增加，远超过了接种初期，这可能也是第10 d 以后藻细胞密度开始下降的重要原因。戴俊彪等[18]研究指出，过强的光照也可能是室外培养条件下球等鞭金藻生长缓慢的原因，当光照强度为（442±94）μmol/（m2·s）时，大溪地等鞭金藻生长得更好，其密度远高于球等鞭金藻，相较而言，大溪地等鞭金藻适合作为高温季节的户外饵料。目前，大溪地等鞭金藻在室外条件下进行培养的研究较少，本研究中其对室外培养条件表现出较强的适应性，生长和繁殖速度较室内培养条件下快，因此认为大溪地等鞭金藻有一定承污能力，经进一步培养优化后，大溪地等鞭金藻的大规模室外培养具有一定的可行性。

大溪地等鞭金藻属于光合自养型单胞藻，光照是其生长的关键因素。一般而言，细胞光合速率决定了藻类生长速度，而光合速率又取决于光合色素的含量，因此光合色素含量变化能反映大溪地等鞭金藻生长发育情况[19]。研究中，在室外培养条件下，大溪地等鞭金藻叶绿素a、叶绿素c 和类胡萝卜素的最大质量浓度分别为0.78，0.26 和14.15 mg/L，其叶绿素a、叶绿素c 质量浓度远低于湛江等鞭金藻，类胡萝卜素质量浓度则更高[20]。出现该结果一方面可能是因为大溪地等鞭金藻叶绿素a 含量较低时，其将吸收的光能主要用于藻细胞数量的增加、生物质和类胡萝卜素的积累以及必须组分的合成，光合色素可满足光能的吸收，因此不需要进行色素的累积[21]；另一方面可能是因为室内光照强度比室外低，此外试验采用摇瓶不充气的方式，也可能因为曝气不充分，使大溪地等鞭金藻的空间位置在较长时间内没有充分置换，进而降低了光能的利用，今后在扩大培养中可通过补充CO2进行改良。在室内培养条件下大溪地等鞭金藻灰分含量显著（P<0.05）低于室外条件下，该结果表明，室外培养条件更利于大溪地等鞭金藻有机物的积累。

4 结论

研究认为，大溪地等鞭金藻具有耐高温和耐强光的特性，适宜在室外条件下培养，因此，该藻作为优质饵料生物在室外规模化培养方面具有一定的可行性。此外室外培养可减少成本投入，提高效益，具有广阔的应用前景。pH 值、温度和光照作为影响大溪地等鞭金藻的3 个重要环境因子，其中光照在很大程度上影响着藻细胞的生长。后期可进一步开展光照强度对藻细胞生化成分的影响研究，进一步推动大溪地等鞭金藻的室外规模化养殖，更好地为水生动物养殖提供优质饵料。