细菌反硝化法测试硝酸盐氮、氧同位素的研究与应用

崔坤磊,尹希杰,李艳利,杨海丽,裴盛祥,苏 静

(1.河南理工大学,河南 焦作454000; 2.自然资源部第三海洋研究所,福建 厦门361005)

随着时代的进步和科技的发展, 在全球范围内, 对氮污染的关注不断提高, 越来越多的人认为其是继生物多样性减少和全球变暖之后的第三大环境问题[1]。水体生态系统由于活性氮的过量输入而遭到污染, 会导致河口、沿海和地表水体的富营养化以及季节性缺氧问题, 还会威胁到饮用水的安全[2-4]。测定水体中硝酸盐的氮、氧同位素组成, 能够对硝酸盐的来源进行示踪, 可以更准确地指示其迁移转化规律, 为水体氮循环研究提供更为丰富和准确的信息,从而制定出更具有针对性的应对措施[5]。

目前国内能够对硝酸盐中氮、氧同位素同时测定的前处理方法有离子色谱法[6-8]、化学转化法[9-13]和细菌反硝化法[14-19]。其中, 离子色谱法容易受到样品中溶解性有机物的干扰, 不适用于高盐度样品，并且所需样品量较大[5,8,20-22]; 化学转化法则需要借助重金属镉和具有高毒性、爆炸性试剂叠氮化钠对硝酸盐进行还原, 环境友好性较差[10,12,23]; 细菌反硝化法则是选用自然界中已经存在的特定反硝化细菌[缺少氧化亚氮(N2O)还原酶], 直接对样品进行生物处理, 反应过程安全高效, 成本低廉, 整个实验过程中不涉及有毒试剂使用, 是当前硝酸盐氮、氧同位素同时测定的一种主要测试方法[14,18-20,22,24-25], 只是该方法在前期准备期间需要涉及微生物培养方面的专业设备和知识, 导致其应用受到一定的限制[20,24,26-27]。

本实验针对3种自然水体(海水、湖水和自来水), 在不同时间采用细菌反硝化法进行了3个批次硝酸盐氮、氧同位素的重复性分析测定, 来验证该方法对不同类型样品中硝酸盐氮、氧同位素测定的适用性, 以及较长测试周期内测定结果的重现性和准确性, 希望能够为细菌反硝化法测定硝酸盐氮、氧同位素技术在国内的应用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 菌种选择与实验原理

本实验所采用的试剂配制及实验条件主要是在前人的经验基础上根据本实验室相关实验结论综合得出。

1.2 主要实验仪器

主要实验仪器有MAT 253稳定同位素比质谱仪(Thermo Fisher公司)、Gas-Bench连续流气体引入装置、两级液氮冷阱预富集装置、自动进样器(CTC analytics Pal)等。

1.3 实验药品

主要培养基和试剂包括：胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、KNO3(GR)、KH2PO4(GR)、(NH4)2SO4(GR)、NH4Cl(GR)、磺胺、N-(1-萘基)乙二胺、NaOH(GR)、HCl(GR)、消泡剂(美国Sigma公司)等。

1.4 试剂配制

1%磺胺溶液：称取磺胺1.0 g溶于100 mL 3 mol/L HCl中, 充分混匀后冷藏保存。

0.02%萘基乙二胺溶液：称取N-(1-萘基)乙二胺0.02 g 溶于100 mL超纯水中, 用棕色试剂瓶或用锡纸包裹, 冷藏保存。

1.5 实验步骤

将复壮后的细菌进行扩大培养, 待菌液通过显色检验后, 浓缩分装, 然后使用高纯N2进行吹扫, 将解冻后的标准溶液和样品用气密性注射器加入到菌液中进行过夜反应, 次日加入NaOH终止反应并吸收CO2, 然后对反应产生的N2O气体进行上机测定, 分析其氮、氧同位素组成。具体实验步骤如图1所示。

图1 细菌反硝化法实验流程

1.6 硝酸盐氮氧标准样品

本实验所采用的标准物质溶液是以IAEA认证的USGS-32(δ15NAir=+180‰, δ18OV-SMOW=+25.7‰)和USGS-34(δ15NAir=-1.8‰, δ18OV-SMOW=-27.9‰)两种硝酸钾同位素标准物质配制出母液, 再将两种标准物质母液以体积比1∶3、2∶2和3∶1混合, 然后再加上两种纯的标准物质溶液, 从而得到了5种氮氧同位素丰度的标准溶液(δ15NAir分别为-1.8‰、43.65‰、89.1‰、134.55‰和180‰, δ18OV-SMOW分别为-27.9‰、-14.5‰、-1.1‰、12.3‰和25.7‰)。

2 结果与讨论

2.1 建立硝酸盐氮、氧同位素校准曲线

如图2和表1所示, 2019年7月28日、8月19日、8月26日不同时间进行的3个批次的细菌反硝化法实验, 分别对5种不同氮氧同位素丰度的硝酸盐标准溶液进行了转化处理和同位素分析测定, 对于每批次内同一丰度样品设置了5个平行对照组(n= 5), 取其平均值, 然后按照以下公式分别拟合得到了与3批次实验相对应的氮、氧同位素校准曲线方程：

表1 3个批次硝酸盐标准物质测试结果及校准方程

图2 3个批次测定硝酸盐标准物质氮、氧同位素校准曲线

(1)

(2)

3个批次氮同位素校准曲线方程的斜率均接近理论值1, 相关性系数都在0.999以上, 表明反硝化细菌在将样品中的硝酸盐全部还原为N2O的过程中所造成的氮同位素分馏效应很小, 能够准确反映样品中硝酸盐的氮同位素组成。同样对3个不同时间段所得到的氧同位素校准曲线方程进行对比, 其斜率与理论值1之间存在0.4左右的偏差, 但3次实验所得到的斜率均稳定在0.61～0.63之间, 并且相关性系数也都在0.99以上, 说明该方法在样品中硝酸盐转化为N2O的过程中所造成的氧同位素分馏效应在每个批次间基本一致, 具有较好的稳定性, 样品的测试结果在经过氧同位素校准曲线的校正后, 也能够准确反映样品中硝酸盐的氧同位素组成。对于空白问题, 在每个批次进行标准物质样品上机测试的同时, 均设置5个空白对照实验, 即在吹扫完成后不加入任何样品, 仅在上机之前加入等量的NaOH试剂进行菌种的灭活。实验结果显示, 每个批次空白组上机测试所得质量为44的信号峰面积范围为0.28～0.35, 而标准物质样品测得的信号峰面积范围为13.00～15.00, 在此情况下空白相当于样品量的1.9%～2.3%, 与Sigman等(2001)[18]得到的结论相一致, 判断在经过2～3 h高纯N2吹扫后的菌液中残留的N2O不会对后续分析测试造成较大影响。

通过对3个批次所得到的硝酸盐氮、氧同位素校准曲线进行对比发现, 2019年7月28日、8月19日、8月26日所对应的氮、氧同位素校准曲线的斜率呈现出规律性递减, 其中氮同位素校准曲线的斜率由0.990 2先降低为0.985 4，再降低至0.966 6, 而氧同位素校准曲线的斜率则从0.630 2降低为0.629 0，再降低至0.610 3。这可能是设计实验时为保证实验条件的相对一致, 3个时间段所选用的反硝化细菌均来自同一平板上的单克隆菌落而忽略了平板上的菌种活性, 该平板在4 ℃的条件下密封保存, 但随着保存时间的增加该平板上细菌的菌龄不断升高, 导致其活性持续下降[30]。活性降低的细菌在将样品中的硝酸盐转化为N2O的过程中所造成的氮、氧同位素分馏效应则逐渐增加, 从而导致对应的氮、氧同位素校准曲线斜率随时间的增加呈现规律性递减。所以, 建议应及时重新活化菌株(每2～3周), 以此来保证反硝化细菌的活性。

2.2 实验样品中硝酸盐氮、氧同位素重现性和准确性分析

表2 3类水样品中硝酸盐氮、氧同位素组成

由于本实验所采用的样品, 均在-20℃的条件下进行密封冷冻储存, 随着样品保存时间的增加, 可能发生了硝酸盐和水之间的氧同位素交换作用, 从而导致海水、湖水和自来水3类水样品中硝酸盐的氧同位素的测定结果在不同时间段呈现出了较大差异。所以, 为防止此类情况的发生, 在样品采集完成后应在尽可能短的时间内进行分析测试, 从而保证测试数据的准确性。另外值得注意的是, 虽然在两个月中进行的多次细菌反硝化法实验所得到的硝酸盐氮、氧同位素校准曲线的重现性和稳定性都很好, 但考虑到每个批次采用的菌液活性和生长状态会存在一些差异[22], 进而导致在硝酸盐转化为N2O的过程中所造成的氮、氧同位素分馏效应的程度不同, 所以每个批次进行测定时都应当采用标准溶液来重新建立校准曲线, 从而消除这部分同位素分馏效应所造成的测量误差。

3 结论

(1)细菌反硝化法在不同时间段所得到的氮同位素校准曲线的稳定性和重现性较好, 在不同时间段同一样品中硝酸盐氮同位素的测定结果基本相同, 说明反硝化细菌将硝酸盐转化为N2O的过程中几乎没有产生氮同位素分馏效应, 在长时间周期内细菌反硝化法能够准确测定样品中硝酸盐的氮同位素组成。

(2)细菌反硝化法在不同时间段所得到的氧同位素校准曲线的稳定性和重现性也较好, 单个批次内海水、湖水和自来水3类样品的测定结果也比较稳定, 但同一样品在不同时间段所得到的氧同位素测试结果出现了较大偏差。鉴于氧同位素校准曲线的良好稳定性和重现性, 以及单批次内同一样品测定结果的一致性, 推测这可能是由于在储存过程中样品所含硝酸盐和水之间发生了氧同位素的交换作用, 从而导致在不同时间段的测定结果之间存在差异。

(3)本研究通过对2019年7月28日、8月19日、8月26日3个时间段所得到的氮、氧同位素校准曲线方程以及3类水样品的测试结果进行分析对比, 验证了细菌反硝化法对海水、湖水和自来水3类水样品中硝酸盐氮、氧同位素测定的适用性、重现性和准确性。

(4)考虑到水样品保存时间和菌种生长状态的差异性, 采样完成后应及时进行分析测定, 并且在每个处理批次内单独设置标准溶液对测试结果进行校正, 以确保所得数据的准确性。