基于核磁共振技术比较厚朴与凹叶厚朴醇提物的化学成分

★ 韩君 李厚聪 张志锋 王晓彤 张志强（.北京康仁堂药业有限公司中药配方颗粒关键技术国家地方联合工程研究中心 北京 00；.湖北民族大学医学部 湖北 恩施 445000；.西南民族大学青藏高原研究院 成都 605）

近年来，随着健康中国战略的实施，以及《关于促进中医药传承创新发展的意见》《中华人民共和国基本医疗卫生与健康促进法》等的施行，国家鼓励培育道地中药材。道地中药材厚朴在四川、湖北等地栽培面积不断扩大，但新的问题也日趋凸显。如四川、湖北等地从江浙地区大量引进凹叶厚朴种源，在同一栽种范围内，厚朴和凹叶厚朴同时存在。目前对两种基原的鉴别存在很多困难，如组织形态学方面两种基原相似性极高，准确鉴别较为困难［1-2］；色谱分析方面主要集中在挥发性成分和非挥发性成分的特征图谱研究［3-5］，然而特征图谱需要大量标准品以及现有研究缺少对厚朴相关化合物的多级质谱裂解途径及其规律的研究，操作性不强；分子生物学方面，前期实验研究采用psbA/trnH 引物和ITS 通用引物对样本进行PCR扩增并直接测序，结果无法区分2 种基原；核磁共振光谱方面，聂映［6］用1H-NMR 技术测定了不同产地厚朴样品的1H-NMR 指纹图谱，但缺乏对凹叶厚朴的研究，Yong Jiang 等［7］发现厚朴变种的1H-NMR 存在差异但不同产地之间无差异，且仅以厚朴酚与和厚朴酚的差异性进行区分，并未结合其它谱图归属不同的信号。

定量核磁碳谱（13C-qNMR）可以弥补1H-NMR共振峰重叠多的缺点，同时13C-qNMR 共振图谱和1H-NMR 共振图谱二者相辅相成，也可以相互印证［8］。核磁共振扩散排序谱（DOSY）是研究复杂混合物体系、归属不同分子谱峰强有力的工具［9］，被喻为NMR 的“色谱”技术，且无须进行实际分离，谱峰分离而非分子的物理分离，即虚分离，保持了混合物体系中原有的化学平衡和化学环境不被破坏，得到更加客观的信息［10-11］。本文应用NMR（1H-NMR、13C-qNMR 和DOSY）综合分析厚朴两种基原的具体化学结构信息、成分相对比例和特征信号描述，为保证道地产区厚朴药材质量具有现实指导意义。

1 材料与方法

1.1 仪器设备与软件 Bruker AVANCE 500 Ⅲ型超导脉冲傅里叶变换核磁共振波谱仪（瑞士布鲁克公司）；TOPSPIN 4.0.8 核磁处理软件；BSA124S型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2 材料与试剂 收集了四川、湖北、浙江、福建4 个省份共10 份厚朴样本，由西南民族大学张志锋教授鉴定为木兰科植物厚朴（Magnolia officinalisRehd. et Wils.）和凹叶厚朴（Magnolia officinalisRehd. et Wils. var.bilobaRehd. et Wils.，）详细信息见表1，氘代甲醇（美国CIL 公司）。

表1 不同产地厚朴样品信息以及厚朴酚与和厚朴酚的HPLC含量测定 %

1.3 方法

1.3.1 NMR 样品制备 称取厚朴和凹叶厚朴样品60 g 置于圆底烧瓶中加无水乙醇1 000 mL，加热回流1 h，提取液于65 ℃减压浓缩，并于60 ℃减压干燥箱中烘干，取固体粉末20 mg 至NMR 样品管中，加入氘代甲醇溶解，用于实验。

1.3.2 NMR 实验条件1H-NMR 的工作频率为500.13 MHz，谱宽为50 000.50 Hz。二位DOSY 采用标准脉冲程序LEDBPG2S 采集，采样温度为298 K，时域点数为4 096，采样延迟时间为1.5 s，扫描次数为8，空扫次数为4，梯度持续时间为1.6 ms，线性梯度变化区间为2 %～95 %。13C-qNMR 采集条件：反转门控去耦脉冲序列zgig，扫描次数NS=8 192，谱宽SW=230 ppm。在对谱图进行处理之前，先进行相位校正和基线调平。所有谱图均采用Topspin 4.0.8软件处理。

2 结果与分析

2.1 厚朴醇提物核磁分析 厚朴醇提物的核磁信号相对比较简单，测试溶剂：氘代甲醇。其1H-NMR（见图1）在芳香区域显示一组典型的1，2，4-三取代苯环信号：7.02（2H，m）、6.84（1H，d，J=8.8 Hz），在烯烃信号区域检测到一组乙烯基：5.96（1H，m）、5.05（1H，brd，J=17.0 Hz）、5.00 （1H，brd，J=10.0 Hz），此外在高场区检测到一个积分值为两个氢的宽双峰信号：3.32（2H，brd，J=6.7 Hz）。其13C-qNMR（见图2）共检测到9 个信号，包括高场区一个信号：40.4、芳香或烯碳区域检测到8 个碳信号——来源于一个苯环与一个双键基团。经过对上述氢碳核磁信号的仔细分析，可得出该结构中含有苯丙素结构单元，考虑到厚朴已报道化学成分的结构特点，提示该结构存在对称因素——即完全对称的苯丙素二聚体，调研相关文献中的核磁数据，最终确定上述信号与厚朴酚一致［12］。

厚朴醇提物的主要成分是厚朴酚，根据氢信号积分值估测含量在90 %以上，而微量的次要成分为和厚朴酚。在核磁图谱中已基本检测不到其它化学成分的信号。

2.2 凹叶厚朴醇提物核磁分析 凹叶厚朴醇提物的核磁信号要复杂得多，其1H-NMR，见图1，除了检测到可归属于厚朴酚的信号外，还检测到如下信号：在芳香区检测到两组苯环的1，2，4-三取代信号：7.22（1H，d，J=2.2 Hz）、7.20（1H， dd，J=8.2， 2.2 Hz）、6.78（1H，d，J=8.2 Hz）；6.98（1H，d，J=2.2 Hz）、6.89（1H，dd，J=8.2， 2.2 Hz）、6.77（1H，d，J=8.2 Hz）、在烯氢区域同样检测到两组乙烯基信号，此外在高场区检测到两组双峰信号：3.37（2H，brd，J=6.6 Hz）、3.29（2H， brd，J=6.6 Hz）。其13C-qNMR（见图2）除了检测到可归属于厚朴酚的信号外，还检测到18 个信号（个别信号有重叠），包括高场区两个信号：40.4、35.3、芳香或烯碳区域检测到16 个信号——来源于两个苯环与两个双键基团。经过对上述氢碳核磁信号的仔细分析，说明该结构是一个不对称的苯丙素二聚体，经与相关文献中的核磁数据比较，可得出上述信号与和厚朴酚一致［13］。

图1 凹叶厚朴（a）与厚朴（b）的醇提取物1H-NMR比较

图2 凹叶厚朴（a）与厚朴（b）的醇提取物13C-qNMR比较

凹叶厚朴醇提物的其它化学成分要明显多于厚朴醇提物。其1H-NMR 中检测到一组特征性的反式烯氢信号：6.34（d，J=15.8 Hz）、7.58（d，J=15.8 Hz）、13C-qNMR 中检测到一个不饱和羧酸碳信号：168.8，在144～150 ppm 区间可见若干碳信号，这些信息表明凹叶厚朴醇提物中还含有微量的咖啡酸（或者咖啡酸类似物）。此外，还可见葡萄糖的端基氢信号：4.72（d，J=7.9 Hz）、鼠李糖的端基氢信号：4.90（d，J=1.5 Hz），结合其碳谱中在100 ppm 附近的两个糖端基碳以及60～80 ppm 区间的若干连氧碳信号，推测凹叶厚朴醇提物中还含有微量的酚苷类成分，且苷元很可能为咖啡酸（或者咖啡酸类似物）。

凹叶厚朴醇提物的主要成分是和厚朴酚与厚朴酚，前者占比稍多，根据氢信号积分值，估测它们的相对含量约为60 %∶40 %。需要特别指出的是，与厚朴醇提物有所不同，凹叶厚朴醇提物的核磁图谱中还可见微量的酚苷类成分。

2.3 NMR 数据分析

2.3.1 NMR 的主成分分析 以10 个不同产地厚朴样品的NMR 变量为数据矩阵，先对数据进行标准化处理后再主成分分析。结果前两个主成分的特征值分别是71.0 %与28.0 %，两个主成分的累计贡献率为99.0 %。以前两个主成分得分矢量绘制主成分得分图，见图3。由图3 可知，10 个不同产地厚朴样品，厚朴与凹叶厚朴各分为两类。

2.3.2 NMR 的聚类分析 采用10 个不同产地厚朴NMR 变量为数据，以欧氏距离计算厚朴与凹叶厚朴的相似性近邻矩阵X，以类平均法计算样本的同现矩阵Y，由X 和Y 得同现相关系数为0.994 4［14-15］。进行系统聚类，绘制系统聚类树图，结果见图4。由图4 分析可知，可将样品聚为两类，即厚朴与凹叶厚朴。

图4 NMR变量数据的层次聚类树图

2.4 厚朴与凹叶厚朴DOSY 分析 DOSY 谱中同一化合物的所有峰都排列在一起，见图5-6，这使得能够更准确地识别复杂混合物中的各种成分。水和氘代甲醇横坐标所对应扩散系数分别为-8.7和-8.9 m2/s，从具有相同分子量（266.33 g/mol）的厚朴酚与和厚朴酚的信号在扩散系数处对齐。样品的核磁谱中，主要信号来自厚朴酚与和厚朴酚，厚朴芳香区的大部分信号低于凹叶厚朴。

图5 凹叶厚朴DOSY谱图

图6 厚朴DOSY谱

3 讨论与结论

3.1 讨论 本文主成分分析是数据标准化处理后得到的结果。数据未标准化主成分分析前两个主成分的特征值分别是98.1 %和1.7 %，累计贡献率为99.8 %，虽然高于经过标准化处理的累计贡献率，但其两者的主成分分类结果一致。

聚类分析时当用欧氏距离，明氏距离或切氏距离时，与标准化欧氏距离层次聚类结果接近，但同现相关系数均小于标准化欧氏距离同现相关系数［14］。故以标准化欧氏距离的聚类算法为佳。

3.2 结论 本文应用NMR（1H-NMR、13C-qNMR和DOSY）综合分析厚朴两种基原的具体化学结构信息、成分相对比例和特征信号描述，证明了厚朴醇提物的主要成分是厚朴酚，根据氢信号积分值估测含量在90 %以上。微量的次要成分为和厚朴酚。凹叶厚朴醇提物的主要成分是和厚朴酚与厚朴酚，前者占比稍多，根据氢信号积分值，估测它们的相对含量约为60 %∶40 %。需要特别指出的是，与厚朴醇提物有所不同，凹叶厚朴醇提物的核磁图谱中还可见微量的酚苷类成分，可以对厚朴、凹叶厚朴进行鉴别和区分。