FRD联合Care HPV在大同地区宫颈癌筛查中的临床研究

高艳萍，赵文娟，赵 康，郭永霞，崔夏夏，朱壮彦

(1.大同市第一人民医院 山西大同 037009,2.阳高县中医院 山西大同 037000,3.山西大同大学医学院 山西大同 037009）

宫颈癌（cervical cancer,CC）和人乳头瘤状病毒（human papilloma virus,HPV）罹患关系的发现使CC的防治取得了突破性的进展。通过宫颈脱落细胞和HPV 的筛查，极大地降低了CC 的发病率和死亡率[1−2]：发达国家和我国沿海地区CC 的死亡率分别降低了67%～74%。然而在经济欠发达地区CC的筛查不能普及，导致CC 的发病率显著高于发达国家和我国沿海发达地区，仍然保持既往的死亡率。因此开发经济实效的CC 筛查技术便成了临床亟待解决的问题，为此国家卫生健康委员会科学技术研究所推出了叶酸受体介导的宫颈特殊染色（folate receptor−mediated tumor detection,FRD）以及Care HPV 技术，并在我国部分地区对宫颈癌进行试点筛查，取得了显著社会效应。FRD 和Care HPV 在大同地区的筛查尚未开展，本研究选取大同市适龄妇女，采用FRD 和Care HPV 技术对CC 展开筛查研究，探究筛查的临床效果并为FRD和Care HPV筛查提供临床数据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用自身对照法，收集2019 年1 月−2021 年1 月大同市第一人民医院门诊就诊患者，共2 000 例，采用FRD 联 合Care HPV 与TCT 联 合Aptima HPV 同 时进行检测。

纳入标准：年龄21～65 岁（平均42.53±18.62岁）、有性生活史的患者。

取材排除标准：宫颈和（或）阴道急性炎症期，经期，妊娠期，在服用叶酸受体介导的抗肿瘤药，筛查前48 h 内阴道和（或）子宫内进行过灌洗或用过杀精剂，筛查前48 h 内进行过宫颈细胞或HPV 检测的样本采集，筛查前7 d内进行过阴道镜检查，筛查前30 d内进行过宫颈组织活检或组织内膜刮取，3 月内使用激素，24 h内有性生活。

我院医学伦理委员会对本研究审核、批准，参与患者对本研究知情同意，征得患者同意后同时行FRD 联合Care HPV 与TCT 联合Aptima HPV 检测，其中FRD 和（或）TCT 阳性者行阴道镜检查并取宫颈活组织，以活检结果为金标准对比TCT 联合Aptima HPV与FRD联合Care HPV检测的临床应用价值。

1.2 检查方法及判断标准

入选病例在常规妇科检查后即行FRD 染色检测，之后进行TCT 检测。Care HPV 和Aptima HPV 取材同TCT。FRD 阳性或TCT 阳性转阴道镜及活检，Care HPV 或Aptima HPV 阳性转阴道镜及活检。各项取材由经过专业培训的妇科医生执行，TCT报告与病理组织活检均由经过专业培训的病理医生完成。

1.2.1 FRD染色

采用购自陕西高源医疗器械服务有限公司的FRD 染色液进行宫颈管染色：将宫颈完全暴露，无菌小头棉签浸泡于FRD 染液中约2 s 至饱和，再插入宫颈管3～5 cm，沿宫颈管内壁顺时针旋转5周，逐步拉出棉签，观察其颜色。宫颈染色：无菌大头棉签浸泡于FRD 染液中约5 s至饱和，用力涂抹宫颈5圈，再按压宫颈约5 s 后取出，观察其颜色。棉签颜色与标准比色卡对比，读取结果需在2 min 内完成，判断标准：浅蓝色、浅绿色，提示宫颈无异常病变，棉签颜色为蓝色、蓝黑色和黑色提示宫颈异常病变，行阴道镜宫颈活检。

1.2.2 TCT检查

采用购自长沙康柏恩医疗科技有限公司的细胞保存液。用无菌细胞刷将刷头伸入宫颈管，深度约1～1.5 cm，顺时针转动5圈取出，取出细胞刷，刷头浸入液体细胞保存液，震荡使脱落细胞保存于液基中，常温保存待检测。病理检测采用TBS 系统分级进行判断：无上皮内病变或恶性病变。

鳞状上皮细胞异常：未明意义的不典型鳞状上皮细胞（atypical squamous cell of undetermined signifi⁃cance,ASC−US）及不除外高度鳞状上皮病变的不典型鳞状细胞（atypical squamous cells−cannot exclude HIS,ASC−H）、LSIL、HSIL、鳞癌（squamous cervical cancer,SCC）。

腺上皮异常：非典型腺细胞（atypical glandular cells,AGC）、原位腺癌、腺癌（adenocarcinoma,AC）。

ASC−US 和AGC及以上的宫颈病变者为阳性，宫颈高度病变为LSIL 及以上者，均需阴道镜检查，并行宫颈活检病取得病理证实。

1.2.3 Care HPV检查

采用购自德国凯杰公司的Care HPV，该技术基于HPV DAN 检测金标准二代杂交捕获技术，采用专利全长8 000 个碱基对的14 种全长RNA 混合鸡尾酒探针，利用核酸杂交和信号放大及化学发光方法，在分子水平对14 种高危HPV 亚型进行检测，无需基因扩增，快速准确。在标本收集后1～3 d完成检测。

1.2.4 Aptima HPV

采用全自动核酸检测系统PANTHER（Hologic）。此方法为不能区分具体型别的定性检测，能直接检测出基于HPV 的2 个致癌基因E6/E7 病毒信使RNA（mRNA）。检测分为靶标捕获、靶标扩增及杂交保护反应3个步骤，在一只试管中可完成。试剂盒内含质控品，可对核酸的捕获、扩增和检测情况以及操作员或仪器出现的错误进行监测。

1.2.5 阴道镜检查及活检取材

采用深圳金科威SLC 2000 电子阴道镜成像系统进行阴道镜检。检查时间为月经干净后3～7 d 进行。一次性窥阴器充分暴露宫颈，阴道镜下放大20倍观察，在宫颈鳞柱交界处3、6、9、12 点以及可疑病变处取材，采集标本标注后置于10% 福尔马林液中保存送病理学检查。

1.2.6 宫颈活组织病理学检查

诊断标准参照2009 年WHO 子宫颈肿瘤组织学分类标准，包括慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变及浸润癌，其中宫颈上皮内瘤变包括LSIL、HSIL 和HG−CGIN，浸润癌分为SCC 及AC。LSIL 及以上定义为病理学阳性病变。

1.3 评价指标

以阴道镜检查结果为金标准，比较FRD、TCT、Care HPV、Aptima HPV、FRD+Care HPV、TCT+Aptima HPV 检测方法的检出及漏诊率与病理活检的一致性；对各种检测方法的特异度、敏感度、阳性预测值、阴性预测值进行比较。其中敏感度=真阳性例数（/真阳性例数+假阴性例数）×100%；特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%；阳性预测值=真阳性例数（/真阳性例数+假阳性例数）×100%；阴性预测值=真阴性例数（/真阴性例数+假阴性例数）×100%。

1.4 统计学方法

所有数据用SPSS22.0软件进行统计分析，计量数据用（）表示，两组之间率的比较用χ2检验来分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FRD分流与病理检测结果比较

病理活检检出124 例阳性患者，检出率为6.20%（124/2000）；FRD 检测127 例阳性患者，检出率为6.35%（127/2000），漏诊率为16.13%（20/124），与病理活检具有较好的一致性（Kappa=0.815，P=0.000）。FRD 检测与病理检出率比较经卡方检验，差异无统计学意义（χ2=0.004，P=0.169）。见表1。

表1 FRD分流与病理结果比较 /例

2.2 TCT分流与病理结果比较

病理活检检出阳性111 例，检出率为6.20%（124/2000），TCT 检测阳性率为130 例，检出率为6.50%（130/2000），漏诊率为14.52%（18/124），与病理活检具有较好的一致性（Kappa=0.821，P=0.000）。TCT检测分流结果与病理组织确诊结果经卡方检验，差异无统计学意义（χ2=0.004，P=0.178）。见表2。

表2 TCT分流与病理结果比较 /例

2.3 Care HPV分流与病理检测结果比较

病理活检检出阳性124 例，检出率为6.20%（124/2000），Care HPV 检测阳性率为114 例，检出率为5.70%（114/2000），漏诊率为16.13%（20/124），与病理活检具有较好的一致性（Kappa=0.811，P=0.000）。Care HPV 检测结果与病理组织确诊率经卡方检验，差异无统计学意义（χ2=0.005，P=0.173）。见表3。

表3 care HPV分流与病理结果比较 /例

2.4 Aptima HPV分流与病理检测结果比较

病理活检检出阳性111 例，检出率为6.20%（124/2000），Aptima HPV 检测阳性率为112 例，检出率为5.60%（112/2000），漏诊率为16.93%（21/124），与病理活检具有较好的一致性（Kappa=0.821，P=0.000）。Aptima HPV 检测分流结果与病理组织确诊结果经卡方检验，差异无统计学意义（χ2=0.006，P=0.168）。见表4。

表4 Aptima HPV分流与病理结果比较 /例

2.5 FRD+Care HPV检测分流与病理检测结果比较

病理活检检出阳性124 例，检出率为6.20%（124/2000），FRD+Care HPV 检测阳性率为128 例，检出率为6.40%（128/2000），漏诊率为4.84%（6/124），与病理活检具有较好的一致性（Kappa=0.618，P=0.000）。FRD+Care HPV 检测分流结果与病理组织确诊结果经卡方检验，差异无统计学意义（χ2=0.003，P=0.292）。见表5。

表5 FRD+Care HPV分流与病理结果比较 /例

2.6 TCT+Aptima HPV 检测分流与病理检测结果比较

病理活检检出阳性124 例，检出率为6.20%（124/2000），TCT+Aptima HPV 检测阳性率为126 例，检出率为6.30%（126/2000），漏诊率为1.61%（2/124），与病理活检具有较好的一致性（Kappa=0.810，P=0.000）。TCT+Aptima HPV 检测分流结果与病理组织确诊结果经卡方检验，差异无统计学意义（χ2=0.004，P=0.216）。见表6。

表6 TCT+Aptima HPV 分流与病理结果比较 /例

2.7 不同检测方法的诊断效能比较

FRD、TCT、Care HPV、Aptima HPV、FRD+Care HPV 和TCT+Aptima HPV 敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值见表7。敏感度FRD、TCT、Care HPV和Aptima HPV各组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05），FRD+CareHPV 和TCT+Aptima HPV 之间比较差异无统计学意义（P＞0.05），但FRD（或TCT、或Care HPV、或Aptima HPV）和FRD+Care HPV（或TCT+Aptima HPV）组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。特异度和阴性预测值各组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。阳性预测值FRD 和TCT 之间比较差异无统计学意义（P＞0.05），Care HPV 和Aptima HPV 之间比较差异无统计学意义（P＞0.05），FRD+Care HPV 和TCT+Aptima HPV 之间比较差异有统计学意义（P＜0.05），但FRD（或Care HPV、或TCT、或Aptima HPV）和FRD+Care HPV（或TCT+Aptima HPV）组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表7 不同检测方法的诊断效能比较 %

3 讨论

FRD 利用宫颈病变细胞内发生异常变化，从而表现出不同颜色来判断病变的性质，是人体上皮组织肿瘤活细胞的染色剂。由于叶酸受体在多数肿瘤细胞表面高表达，在正常细胞表面少表达，所以叶酸复合物作为肿瘤特殊靶向介导分子用于诊断技术[5]。FRD 染液涂抹于宫颈上皮后的病变细胞，叶酸衍生物就会与其表面的叶酸受体结合进入细胞质，激活细胞质内亚铁离子，使无色的还原态亚甲蓝迅速生成氧化还原态的亚甲蓝并溢出细胞外，表现为变色反应[6]。Care HPV 是在杂交捕获技术（hybrid capture 2,HC2）的基础上引入磁珠捕获的方法，采用互补性RNA 探针与宫颈脱落细胞中HPV DNA 进行杂交形成DNA 和RNA 杂交物，在微孔板中定性检出宫颈标本中14种高危人乳头瘤状病毒利用核酸杂交和信号放大及化学发光方法[7−8]。本研究发现FRD 对宫颈病变的检出率为6.35%，与病理活检确证率6.20%之间差异无统计学意义，Care HPV 检测阳性率为5.70%，与病理活检检出率6.20%差异无统计学意义,FRD 和Care HPV 在CC 筛查中检出率和病理确证率的一致性提示FRD和Care HPV在宫颈病变筛查中有重要的临床意义，这与Xiao等[9]和Simms等[10]研究成果一致。

TCT通过采集阴道或宫颈分泌物，获得脱落细胞后浸入液基细胞处理试剂中进行处理，可用HE 染色、巴氏染色或其他免疫组织化学染色等方法使细胞着色，再通过人工观察分析来检查阴道或宫颈的细胞形态，诊断子宫颈癌及其癌的前期变化[11−12]。Aptima HPV 利用PCR 技术扩增靶物HPV E6/E7 mRNA，然后以核酸杂交的方式获取14 种高危型HPV。Aptima HPV 提供HPV16 E6/E7 mRNA 和（或）HPV18 E6/E7 mRNA 基因分型报告，并将其他12 种高危型别HPV 混合报告[13−14]。本研究发现TCT 对宫颈病变的检出率为6.50%，与病理活检确证率6.20%之间差异无统计学意义，Aptima HPV 检测阳性率为5.60%，与病理活检检出率6.20%差异无统计学意义，TCT 和Aptima HPV 在CC 筛查中检出率和病理确证率的一致性提示TCT和Aptima HPV 在宫颈病变筛查中有重要的临床意义，这与Fan等[15]和Ruan 等[16]研究成果一致。

西方发达国家和我国东南沿海经济发达的省市CC 发病率呈逐年下降趋势，而在发展中国家呈上升趋势，这与其是否拥有完善的“细胞学/HPV、阴道镜、病理学检查”三阶梯CC 筛查模式密切相关[17]。细胞学和HPV 的联合检测不仅提高了检出率，还降低了漏诊率，显著提高了筛查效率[18]。本研究FRD 联合Care HPV 检测阳性率6.40%，与病理活检检出率6.20%差异无统计学意义，然而漏诊率4.84%，较FRD的16.13%和Care HPV16.13%显著降低。本研究中TCT联合Aptima HPV 对检测阳性率6.30%，与病理活检检出率为6.20%差异无统计学意义，然而漏诊率1.61%，较TCT 的14.52%和Care HPV 的16.93%显著降低。提示细胞染色联合HPV 检测较单独采用细胞学或HPV 筛查能提高漏诊率，提高与病理结果的符合率。

敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值是衡量检测方法的基本指标，尤其是敏感和阳性预测值是衡量漏诊的主要指标[19]。本研究发现FRD、TCT、Care HPV 和Aptima HPV 之间敏感度差异无统计学意义，但FRD 联合Care HPV（或TCT 联合Aptima HPV）与FRD（或TCT、或Care HPV、或Aptima HPV）比较，敏感度显著提高，而FRD 联合Care HPV 和TCT联合Aptima HPV 之间差异无统计学意义；阳性预测值FRD 和Care HPV、TCT 和Aptima HPV、FRD 联合Care HPV 和TCT 联合Aptima HPV 之间敏感度差异无统计学意义，但FRD（或Care HPV）、TCT（Aptima HPV）、FRD 联合Care HPV（或TCT 联合Aptima HPV）组间比较差异有统计学意义，这提示细胞学和HPV联合检测可以提高检测的阳性预测值，有助于提高检查率，降低漏诊率。这与古力米热·乃扎尔等[20]和Zhang等[21]的研究结果相一致。

总之，FRD 联合Care HPV（或TCT 联合Aptima HPV）均能提高检出率，降低漏诊率，同时提高敏感度和阳性预测值，是提高宫颈病变筛查的有效途径。然而TCT和Aptima HPV 不仅费用高，而且耗时长，对工作人员的要求较高，不仅需要专职的病理医师，还需专项性高的检验医师，同时并不能降低检测的误差率，不能在经济条件落后地区大面积展开。FRD和Care HPV 的研发，不仅解决了费用问题，还解决了技术难度问题，FRD 和Care HPV 操作简单方便，费用仅为TCT 和Aptima HPV 的10%左右，而FRD 和Care HPV 联合检测敏感度、阳性预测值、检出率、漏诊率、和病理确证的符合率都TCT 和Aptima HPV 接近，特别适合包括我国在内的发展中国家。