池塘养殖患病黄颡鱼病毒病原的电镜观察初报

刘文枝，薛明洋，周勇，李逸群，范玉顶，孟彦，曾佳，曾令兵,

（1.中国水产科学研究院长江水产研究所，湖北 武汉 430223；2.华中农业大学水产学院，湖北 武汉 430070）

黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco 肉质细嫩、营养丰富、养殖方式多样（单养、混养、网箱养殖），是我国广泛养殖的肉食性为主的杂食性小型名优经济养殖鱼类[1]。我国黄颡鱼养殖产业发展迅速，2018年总产量达51 万t[2]。近些年来，黄颡鱼的病害研究大多集中于细菌、真菌和寄生虫等病原[3-11]。2020 年3—4 月浙江湖州、湖北枝江、潜江等黄颡鱼主养区域发生黄颡鱼暴发性疾病，随后，四川、重庆、湖南、广西、广东等地区相继暴发，给黄颡鱼养殖业造成了巨大经济的损失，但病因不明。

2020 年4 月中旬，湖北省潜江市某黄颡鱼养殖场发生了黄颡鱼暴发性死亡，临床症状主要表现为鱼下颌基部出血。该病传播迅猛，发病率约40%～60%，死亡率高达70%～80%，病程一般为3～5 d，发病水温20～24℃，抗生素药物治疗无效。本文对典型患病黄颡鱼组织样本进行了超薄切片和电镜观察，旨在为黄颡鱼疾病的病原学研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

患病黄颡鱼于2020 年4 月采自湖北省潜江市某黄颡鱼养殖场，病鱼体质量约为20～30 g。选取濒死、下颌出血的患病黄颡鱼脾脏、肾脏等组织器官固定在2.5%戊二醛溶液中，用于超薄切片电镜观察。

1.2 电子显微镜切片的制备与观察

从固定液中取出约1 mm3的组织块，以体积分数为1%的OSO4（pH7.2）固定1～2 h。随后置于乙醇-丙酮中进行序列脱水，环氧树脂Epon812 浸透包埋。用超薄切片机（Leica UC7，Germany）进行超薄切片，将切片用铀和铅联合染色后，用透射电子显微镜（Hitachi-7650,Japan）观察[12]。

2 结果与分析

2.1 患病黄颡鱼临床症状

患病黄颡鱼头部、口腔、鳃盖及下颌基部出血（图1-A）。解剖发现：患病黄颡鱼脾脏充血，肾脏肿大，弥散性坏死（图1-B、图1-C）。

图1 患病黄颡鱼的临床症状Fig.1 Gross pathological signs of diseased yellow catfish

2.2 电镜观察

透射显微镜下观察发现，患病黄颡鱼组织中细胞病变明显，细胞核固缩或染色质边缘化，脾脏和肾脏组织内有大量的球形病毒样颗粒。这些球形病毒颗粒无囊膜，直径约30～40 nm（图2-C、图2-F）；病毒粒子分布在宿主细胞的细胞质中，有的由单位膜包裹在包涵体中（图2-D），而正常黄颡鱼组织中未观察到球形样病毒颗粒（图2-A、图2-B）。

图2 患病黄颡鱼脾脏和肾脏组织球形病毒颗粒电镜观察Fig.2 Spherical virus-like particles in the spleen and kidney of the diseased yellowd catfish under transmission electron microscopy

3 讨论

近几年，我国黄颡鱼养殖发展迅速，产业规模不断扩大，黄颡鱼病害也越来越突出。但是，目前对黄颡鱼疾病的研究较少，仅有的报道主要集中在细菌性病原[3-8]。周勇等[3]从体表患典型腹水病的黄颡鱼肝脏中分离鉴定出维氏气单胞菌Aeromonas veronii，病鱼的主要症状是腹部膨大，腹腔内含有大量积水，无鳍条充血症状。张涛等[4]通过病理组织分析结果发现患腹水病黄颡鱼鳃、肝、脾、肾、胃、肠等组织器官均发生不同程度病变，病原菌对鱼体各部位的组织功能均造成一定影响，其中肾组织病变严重。爱德华氏菌Edwardsiella ictaluri 感染的养殖黄颡鱼主要症状为头顶部皮下充血、发红、溃烂，病情严重的头骨裂开，暴露出脑组织[5,6]。胡宗云等[7]在患“红头病”的黄颡鱼体内分离到病原菌为蜡状芽孢杆菌。2015 年江苏淮安地区暴发的养殖黄颡鱼出血性肠炎病原鉴定为嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila[8]。叶仕根等[9,10]报道，在人工养殖黄颡鱼过程中还会出现真菌性疾病感染，如水霉病和鳃霉病。寄生虫疾病也偶有报道[11]。

本研究中患病黄颡鱼主要症状为头部、口腔、鳃盖和下颌基部有明显出血现象；解剖内脏发现脾脏、肾脏等器官出现严重病变。但病鱼的体表光滑，头部无穿孔现象，腹腔内亦无腹水。本研究也开展了细菌分离研究，但未分离到以上所报道的细菌病原，也未观察到真菌病原。在光学显微镜下观察，仅鳃部有少量车轮虫寄生，但它不是引起黄颡鱼死亡的主要病因。本文所采集的患病黄颡鱼的养殖场在使用杀虫药和抗生素后，发病情况未见改善。

黄颡鱼病毒性疾病的研究鲜有报道。2019 年Zhang 等[13]在患病的黄颡鱼体内分离到一种杆形病毒。经分子生物学鉴定，该病原与水生动物的白鳊病毒（white bream virus,WBV）有一定同源性。但是，由于缺乏病毒在感染黄颡鱼组织上的超微结构的电镜观察结果，其致病机理尚不清晰。本研究在患病黄颡鱼的肾脏、脾脏等组织中首次观察到了球形病毒样颗粒，根据其形态、大小及存在形式等特征，推测球形病毒颗粒与小RNA 病毒科成员相似，但要准确确定其分类地位尚需要大量的生物学和分子生物学鉴定工作。目前，关于该病毒病原的病原学、流行病学、分子检测等工作正在开展之中。黄颡鱼病毒病原的发现，可为黄颡鱼养殖过程中暴发性流行病的病原学、流行病学、免疫和防控技术研究奠定了基础。根据本研究的初步结果，建议黄颡鱼养殖生产过程中对于病毒性疾病应以预防为主，合理控制养殖密度和饲料投喂量，以降低黄颡鱼病毒性疾病的发生率。