基于微卫星标记的图们江大麻哈鱼遗传多样性分析

闫春梅，郑伟，高春山，韩叶，李忠强，李秀颖

（吉林省水产科学研究院，长春 吉林 130033）

大麻哈鱼Oncorhychus keta 属鲑形目Salmoniformes 鲑科Salmonidae 太平洋鲑属Oncorhynchus的冷水性洄游鱼类[1]，在中国分布于黑龙江、图们江、乌苏里江、松花江、珲春河、密江、绥芬河、嫩江、牡丹江以及台湾省的大甲溪等水系。水利工程阻碍了大麻哈鱼洄游通道，破环了自然产卵场和索饵场，大麻哈鱼自然种群数量急剧下降，2007 年被列入《中国国家重点保护经济水生动植物资源名录（第一批）》，多年来依靠人工增殖放流补充其自然资源量。近年来，有关大麻哈鱼的群体年龄组成及生长性状[2-4]、繁殖力[5-7]、种群结构[8-11]、生物学性状[12-14]及放流标记方法[15-17]和放流效果评估[18,19]等已有研究。但人工增殖放流活动对图们江大麻哈鱼野生自然种群的遗传多样性和遗传结构的影响未见报道。

遗传多样性及遗传结构的分析是评估种质资源现状的主要途径和种质保护的核心内容，也是增殖放流工作的重要环节，具有重要的作用[20]。用于增殖放流的群体必须具有丰富的遗传多样性。在群体遗传结构和遗传多样性分析过程中，微卫星标记法的分辨率高，可以检测共显性遗传，已成为有效的热门标记手段[21-25]。本实验利用已发表的10 对微卫星引物[26]，分析了2015、2016、2017 及2018 年在图们江采捕到的大麻哈鱼亲鱼的遗传多样性及遗传结构，并分析人工增殖放流是否会影响大麻哈鱼群体的遗传多样性，可为大麻哈鱼种质资源保护、恢复大麻哈鱼野生自然群体资源量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用大麻哈鱼样品采捕于中国吉林省图们江流域，总计169 尾，其中2015 年62 尾，2016 年29 尾，2017 年28 尾，2018 年50 尾，分别取鳍条样本置于95%乙醇中备用。

1.2 基因组DNA 提取

用超纯水冲洗鳍条样本，去除残余乙醇。晾干后剪碎，按照DNA 提取试剂盒（鼎国昌盛生物公司）说明书提取基因组DNA。经OD260/280分析测定DNA 浓度后，稀释至100 ng/μL，-20℃保存备用。

1.3 PCR 扩增

本研究所用10 对微卫星引物均由本实验室开发，引物多态性良好，GenBank 登录号为MH619620-MH619629（表1）。由上海生物工程有限公司合成荧光引物。PCR 反应体系中含有10×PCR Buffer 1 μL，dNTP 0.2 μL，MgCl20.4 μL，引物各0.2 μL，Ex Taq 酶0.04 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 补足至10 μL。94℃2 min，（94℃30 s，Tm 30 s，72℃30 s）5 个循环，（94℃30 s，50℃30 s，72℃30 s）30 个循环，72℃5 min。应用3730xl 基因分析仪检测PCR 产物。

表1 引物序列Tab.1 The sequences of primer used in the experiment

1.4 数据分析

所有数据采用PopGen 32 软件处理，计算等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、香农信息指数（I）、Hardy-Weinberg 平衡检验（P）、近交系数（Fis）、分化系数（Fst）和基因流（Nm）。采用PIC-CALC 计算平均多态信息含量（PIC）。

2 结果与分析

2.1 SSR 基因分型结果

利用10 个微卫星位点对169 尾大麻哈鱼鳍条样本进行荧光PCR 反应，产物经毛细血管电泳检测后，根据荧光标记的颜色，用软件Genemapper 分析基因型，读取单个大麻哈鱼样本在各个微卫星位点的基因型片段大小（图1）。

图1 大麻哈鱼微卫星引物在个体中的等位基因峰图Fig.1 Electropherogram peaks of microsatellite primers in chum salmon

2.2 遗传多样性

应用10 对微卫星引物估算了图们江大麻哈鱼2015、2016、2017 及2018 年4 个群体的Na、Ne、Ho、He、I 和H-W（表2）。由表2 可知，4 个年度群体中共检测到Na 397 个，Ne 为4.7853～6.1309，Ho 为0.6500～0.7200，He 为0.7663～0.8359，I 为1.8128～1.9836。利用PIC 计算软件计算群体平均多态信息含量为0.7288～0.8017，均为高度多态（PIC＞0.5）。

表2 4 个年度群体的10 个微卫星位点的遗传多样性分析Tab.2 Parameters of genetic diversity analyzed by ten loci in populations of chum salmon in four years

10 对微卫星引物在4 个群体中进行Hardy-Weinberg 平衡检验，所有位点均为多态位点，其中符合H-W 平衡的位点有18 个（P＞0.05），其他22 个位点偏离H-W 平衡（P＜0.05）。

2.3 群体间遗传结构

2015—2018 四年的大麻哈鱼群体的10 个微卫星标记近交系数中，分别有8、7、9、5 个位点为正值，平均值为0.0298～0.1758。通过基因流（Nm）和群体间遗传分化系数（Fst）分析可知（表3），Nm＜1 的位点0 个，1＜Nm＜4 的位点6 个，其他4 个位点Nm＞4。群体间平均遗传分化系数为0.0755。

表3 10 个微卫星位点的遗传分化系数及基因流Tab.3 Fst and gene flow of 10 polymorphic loci

这4 个年度大麻哈鱼群体的遗传相似系数为0.4505～0.8249，其中2015 年和2017 年群体遗传相似系数最大（0.8249），2016 年和2018 年群体遗传相似系数最小（0.4505）。遗传距离为0.1925～0.7974，其中2016 年和2018 年群体遗传距离最大（0.7974），2015 年和2017 年群体遗传距离最小（0.1925）。

3 讨论

3.1 图们江大麻哈鱼生殖洄游群体遗传多样性

本研究利用10 对已发表的高度多态微卫星位点（PIC＞0.5）分析了图们江4 个年度大麻哈鱼群体的遗传结构及多样性。这些位点遗传多样性较丰富，适宜用于大麻哈鱼群体的遗传多样性评估[26]。

表4 大麻哈鱼4 个群体Nei 氏遗传相似系数（上三角）及遗传距离（下三角）Tab.4 Nei’s genetic identity（diagonal above）and genetic distance（diagonal below）in four groups of chum salmon

遗传多样性是种内个体之间或一个群体内不同个体的遗传变异总和，是一个物种成功应对人为干扰的决定因素。遗传多样性程度决定着其进化趋势[27]。本研究利用10 对微卫星标记分析了图们江大麻哈鱼4 个年度生殖洄游群体的遗传多样性，主要分析了等位基因数、有效等位基因数、杂合度、多态信息含量、香农指数和Hardy-Weinberg 平衡检验等。结果表明，4 个群体平均等位基因数：9.7～10.6；平均有效等位基因数：4.7853～6.1309；平均观测杂合度为0.6500～0.7200，平均期望杂合度为0.7663～0.8359。杂合度是指随机抽取的样本中两个等位基因不相同的可能性。期望杂合度主要是根据种群内当前优势等位基因的分布频率来推算的。而观测杂合度是随机抽取的两个样本的等位基因不相同的概率。杂合度越高说明遗传多样性越丰富[28]。虽然图们江大麻哈鱼人工增殖放流活动已开展十余年，但其群体遗传多样性仍较丰富，平均期望杂合度甚至略高于Chen 等[29]2005 年对图们江流域大麻哈鱼群体的评估结果。

平均多态信息含量（PIC）表示一个后代所获得某个等位标记来自其亲本的同一个等位标记的可能性，分为低度（＜0.25）、中度（介于0.25～0.5 之间）和高度多态位点（＞0.5）[30]，通常用来评估遗传多样性丰度。据此，本研究中10 个微卫星分析4 个图们江大麻哈鱼群体的平均多态信息含量为0.7288～0.8017，均大于0.5，属于高度多态性群体。

Hardy-Weinberg 平衡条件是：无限大的群体；随机婚配；没有突变；没有选择；没有迁移；没有遗传漂变（小群体内基因频率随机波动）[31]。但实际应用中，一般没有完全符合理想情况的群体。用P 值衡量群体的基因型分布与H-W 平衡偏差的程度，P值越低表示偏差越大。本研究中可能样本量不足、分型有误或样本选取偏差，40 个多态位点中仅29个符合H-W 平衡[32]。

3.2 图们江大麻哈鱼生殖洄游群体间遗传结构

基因流（Nm）和群体间遗传分化系数（Fst）是用来分析群体间遗传分化程度的两个重要参数。Slatkin[33]和Hamrick[34]认为，Nm 越小群体分化程度越大。本研究中10 个位点的平均Nm 值为3.0598，介于1～4 之间，表明群体间发生了一般程度的基因交流。

通常用Fst（Fixation index）来衡量群体之间的遗传分化。Fst 为1 说明两个群体完全独立；0 说明两个群体之间自由杂交。Fst 值越大，说明遗传距离越远；值越低，说明大多数的遗传变异发生在同一个群体内。Wright[35]建议，实际研究中，Fst 小于0.05，可以忽略不计；Fst 介于0.05～0.15 之间，表明遗传分化程度中等；Fst 高于0.15 则遗传分化程度较大。本实验Fst 为0.0755，说明约有92.45%的遗传变异存在于种群内，7.55%的遗传变异存在于种群间，属中等程度的遗传分化。群体内近交系数为正值，表明群体内近交明显。

遗传相似性和遗传距离能够衡量出群体间的遗传关系[36]。本研究中，2015 年和2017 年群体遗传相似系数最大（0.8249），遗传距离最小（0.1925），亲缘关系最近。相反，2016 年和2018 年群体遗传相似系数最小（0.4505）。遗传距离最大（0.7974），亲缘关系最远。

为补充大麻哈鱼种质资源量，每年都开展大麻哈鱼人工增殖放流活动，但由于放流群体和自然群体之间存在遗传差异，势必会对自然种群产生负面影响[37]，必须建立科学合理的人工增殖放流体系，检测人工增殖亲本的遗传多样性和遗传结构，这对保障人工增殖放流效果具有重要意义。本研究表明：中国图们江大麻哈鱼生殖群体遗传多样性较高，具有一定的遗传潜力，可作为选育群体。建议不同增殖群体可在不同流域交叉放流，使群体遗传多样性更加丰富，最大限度减少人工增殖放流对野生群体遗传结构及多样性的影响[38]。