基于EST-SSR标记的陕西茶树种质资源遗传多样性研究

班秋艳，潘宇婷，潘 铖，胡 欣，李叶云，江昌俊

(1 安徽农业大学 茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036；2 河南农业大学 园艺学院，河南 郑州 450000；3 陕西苍山秦茶集团有限公司，陕西 西安 710002)

中国西南地区是茶树(Camelliasinensis(L)O.Kuntze)的起源中心[1-2]。茶树作为重要的经济作物，目前在50多个国家广泛种植[3-4]。中国茶树种质资源丰富，具有较高的遗传多样性，在漫长的历史发展过程中，茶树种质资源经自然演化和人工创造形成一种重要的自然资源，蕴藏着各种性状的遗传基因[1]。茶树遗传多样性是生物多样性的一个重要组成部分，对某些地区濒危物种遗传多样性和结构遗传的研究,将有助于加深对其进化及适应潜力的认识，并有助于最佳保护策略的确定[5]。

种质资源的科学鉴定和评价是优异资源发掘和利用的前提，国内外学者从形态学、细胞学、生化和分子水平进行了大量研究[6]。茶树是自交不育、高度异质化的一类作物，利用形态和生理生化特征来描述茶树的表型性状，是农艺性状鉴定的重要依据，这对茶树品种的鉴定具有很高的参考价值。但表型性状易受环境的影响，出现连续性变异或高度的可塑性，不能充分体现品种间和品种内的多态性[7]。近年来，各种DNA分子标记被应用于茶树资源的遗传多样性、鉴定和分类研究[8-9],如随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、限制性片段长度多态性(RFLP)、简单序列重复(SSR)和启动密码子靶向标记(SCoT)等,为评估茶树资源的遗传多样性和遗传关系提供了很好的信息途径[10-12]。迄今为止，简单序列重复标记因其共显性遗传、多等位基因性、高基因组丰度、基因组覆盖范围广等特点,在茶树中得到了广泛的应用[13]。

陕西茶区是我国北方茶区之一，有着悠久的茶叶种植历史。其北屏秦岭、南倚巴山，境内气候终年温和湿润、雨量充沛，长期的自然演化和人工选择造就了丰富的能适应北亚热带和暖温带生境条件的灌木、中小叶型茶树资源，是我国重要的茶树种质资源基因库[2]。在1981-1984年陕西的茶树资源调查中，程良斌[14]将陕西省茶树种质资源分为7大类。李剑等[15]利用石蜡制片技术评价陕西茶树品种的抗寒性，观察到其具有叶片较小, 栅栏组织层数多、厚度大, 栅栏组织与海绵组织比值及上表皮与海绵组织比值较高的特点。Zhang等[16]和陈熙[17]利用分子标记技术分析了陕西秦巴地区的茶叶资源，发现它们具有高度多态性的特点。陕西省茶树栽培品种以地方群体种为主[14]，省级无性茶树品种只有陕茶1号。由于陕西茶区地形复杂，交通不便，相比于我国南方茶区，茶树资源的研究不够系统和深入，致使陕西茶树种质资源没有得到充分利用。虽然陕西在茶树种质资源考察、鉴定评价等方面取得了一定的研究进展，但陕西省茶树种质资源在分子水平上的遗传进化关系尚未得到充分研究利用。因此，探索陕西省茶树资源的遗传多样性具有重要意义。

在新时期，任何企业与单位的发展都离不开人才的支持。现代社会之下，所需求的是具备知识与实践相结合的技术型人才，不仅要具备专业的技术能力，还需要具备优良的个人素质。从行政事业单位的角度来看，关键岗位的人才配备工作成为了重点，所以在财务人员的培养与素质提升工作当中，可以从多个角度进行改进与优化。不仅要针对在岗人员的素质进行管理，定期组织相关活动进行经验沟通；另一方面，按照企业内部的发展规划与实际需求，展开后备人才培训工作，重点对刚入职的员工展开合理培训，辅以合理的激励措施，提升队伍建设水平。

笔者前期调查了陕南茶区汉中、安康两市10个地点的88种不同形态的茶树资源，并分别从形态和生化成分两方面鉴定了陕西省茶树资源的多样性[18-19]。然而，形态和生化标记常常受到地理环境的影响，因此本研究利用表达序列标签简单序列重复(EST-SSR)分子标记对陕西省茶树资源的遗传多样性和遗传分化进行分析，以期为江北茶区茶树资源的利用和新品种的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源及处理

供试茶树资源共118份，其中88份资源来自陕西省，30份资源来自湖北、安徽、湖南、四川、广西、贵州和云南等地，样品详细信息见表1。新鲜植物叶片采摘后立即用硅胶干燥于-80 ℃下储存。

表1 供试茶树材料的名称及原产地信息Table 1 Name and origins of tested tea resources

表1(续) Continued table 1

《德国刑事诉讼法典》将“通讯监听”与“扣押”、“搜查”并列规定于同一章节[5]，并且将“通讯监听”视作与“扣押”、“搜查”同等性质的侦查措施。在德国，监听实行法官令状主义，并且针对不同情形的监听分别规定了不同的适用条件，但是，《德国刑事诉讼法典》并未对偶然监听所得材料的证据能力作出规定。对于合法监听时偶然获得的另案证据是否予以排除，德国学说和实务主要存在以下四种不同见解[6]：

1.2 EST-SSR标记与PCR扩增

改善系统频率稳定性的多直流功率紧急支援协调控制策略//许涛,吴雪莲,李兆伟,张剑云,郄朝辉,刘明松,等//(22):69

利用Powermarker V3.25软件对陕西省茶树的EST-SSR序列信息进行评价，结果表明，陕西省茶树的MAF为0.348 6，基因型为17.116 3个，Na为7.139 5，Ho为0.818 2。陕西省茶树具有高度多样性，其H值和PIC值分别为0.750 4和0.716 7。

1.3 数据分析

图2表明，陕西省88份茶树种质资源可分为A、B、C共3组。其中A组包含3份茶树资源，分别为紫阳县城关镇青中村的7号材料、西乡县大河镇石马村的41号材料和镇巴县兴隆镇大河村的63号材料。B组包含6份材料，分别为紫阳县麻柳镇染房村的14、38、68号材料，西乡县大河镇石马村的24号材料，紫阳县城关镇青中村的32号材料和宁强县青木川镇玉泉坝村的20号材料。C组类群较大，故根据遗传距离将C组分为9个亚组(C1-C9)，包括除镇巴县兴隆镇大河村外的9个地点的79份材料。其中C1类群包含23份材料，7份来自紫阳县城关镇青中村的材料聚在一起；C2类群包含5份材料，其中2份来自镇巴县兴隆镇青狮村；C3类群包含6份材料，其中3份来自紫阳县麻柳镇染房村；C4类群包含2份材料，均来自紫阳县麻柳镇染房村；C5类群包含11份材料，其中5份来自紫阳县麻柳镇染房村，3份来自西乡县大河镇石马村；C6类群包含22份材料，其中8份来自紫阳县麻柳镇染房村，5份来自宁强县青木川镇玉泉坝村，4份来自紫阳县城关镇青中村，4份来自西乡县大河镇石马村；C7类群包含3份材料，2份来自西乡县大河镇石马村；C8类群包含4份材料，2份来自宁强县青木川镇玉泉坝村；C9类群包含3份材料。

用陈熙[17]、Freeman等[20]、姜燕华[21]公布的105对EST-SSR引物对茶树材料进行扩增，对其多态性和退火温度进行确定和筛选，从中选取扩增条带清晰、多态性丰富的43对引物，引物合成由上海生工生物有限公司完成。参考Liu等[13]的方法，PCR扩增体系(20 μL)为：模板DNA(约50 ng/μL)2 μL，10×PCR缓冲液2 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.2 μL，引物(10 μmol/L)0.5 μL，Taq聚合酶0.5 μL,ddH2O补足。PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性50 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增的SSR片段在96通道毛细管电泳全自动核酸分析仪(Fragment AnalyzerTM96)上进行分离。试剂为双链DNA试剂盒DNF-900(Advanced Analytical Technologies，Inc.)，包括FA-dsDNA凝胶、5×930 dsDNA缓冲液、1×TE稀释缓冲液、插层染料、标记物、DNA Marker(分别为35，75，100，150，200，250，300，400和500 bp)、5×毛细管调节液、毛细管储存溶液和矿物油。根据DNA浓度，用1×TE稀释液稀释PCR产物约10倍。将2 μL PCR产物和18 μL 1×TE混合液加入到96孔板中，在96孔板的D12和H12位置加入24 μL DNA Marker，以分离出35～500 bp的扩增片段，辨析不同等位基因之间1 bp的差异。将数据进行标准化，并使用PROSize 2.0软件校准。选择清晰、亮度高的条带进行后续分析。

利用Powermarker V3.25软件和原始数据，计算物种水平和群体水平的主等位基因频率(major allele frequency,MAF)、基因型(genotype)、等位基因数Na(observed number of alleles)、观测杂合度Ho(observed heterozygosity,)、Nei基因多样性指数H(Nei’s genetic diversity index,)、多态信息含量PIC(polymorphic information content)和Nei’s遗传距离[23-24]。基于Nei’s遗传距离，利用MEGA 6软件进行UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean)聚类，并绘制聚类图[25]。

SSR多态信息含量的计算公式为：

式中：Pi表示第i个等位位点出现的频率。当PIC≥0.5时，该基因座为高度多态性；0.25≤PIC<0.5 时，为中度多态性；当PIC<0.25时，为低度多态性。

2 结果与分析

2.1 茶树EST-SSR标记的扩增结果及多态性分析

用43对EST-SSR引物在118份茶树材料中共检测到310个等位基因和832个基因型。各标记的MAF在0.150 4～0.865 9，平均为0.336 8。每个位点的等位基因数为2～14个，平均为7.21个；扩增的基因型为3～57个，平均为19.35个。43对SSR位点的PIC值在0.205 3～0.904 2，平均为0.727 2，表明我国茶树具有较高的遗传多样性。这些微卫星位点在所有样品中均有良好的扩增。遗传多样性分析结果表明，H在0.232 3～0.911 0，平均为0.760 0；Ho在0.105 7～0.991 8，平均为0.811 2(表2)。其中引物A168在部分材料中扩增的EST-SSR条带见图1。

表2 43对EST-SSR引物序列信息及在118份茶树材料中的遗传信息Table 2 Sequence information of 43 EST-SSR primers and genetic information in 118 tea plants

表2(续) Continued table 2

“老师，您喜欢栀子花吗？！我们这里栀子花很常见，以为您这个城里来的老师看不上呢！所以大家都不敢送给您，怕您嫌弃。既然您喜欢，那我们天天给您送，送最大朵、最香的……”

A1-H12代表样本在96孔板的位置A1-H12 represents the position of the sample on the 96 well plate图1 用A168引物从部分茶树材料中分离出的EST-SSR条带Fig.1 Segregation of EST-SSR bands amplified with primers A168 from partial tea materials

2.2 88份陕西茶树资源的亲缘关系分析

根据电泳结果，利用PROSize 2.0软件统计目的片段范围内清晰且重复的条带，同时结合人工读带，根据分子质量的大小，从大到小依次记作A、B、C、D、E……，一条带为纯合，两条带为杂合，分别记录，如AA、AB、BC、BD、DE、EE等，不同的引物因等位基因的位置而异，获得原始数据，建立矩阵[22]。

1～88代表种质编号,且与表1相同1-88 represents the germplasm number,the same as Table 1

2.3 8个省份茶树资源的系统进化分析

有学者说：“犹太人之所以是犹太人，就是因为他们代表了不断强调自己‘差异’的他者；犹太教之所以是犹太教，就是因为它从来不以某一特定的纯粹形式存在。”①其实，《摩西五经》文本中的重复和重复中的差异，甚至矛盾，是因为文本是多人在不同时间、不同时代书写造成的，是由于实际记录者多人、多次叙述，记录的年代不一样，各种学科当时也没有分开，甚至于都没有出现，所记述的事物便会有重复、自相矛盾的混乱。

根据共有等位基因的遗传距离，对源自8个省(自治区)的118份茶树资源进行聚类分析。由于陕西省茶树材料数量多，在很大程度上会影响聚类结果，故本研究中陕西省的材料以村庄为单位，其他以省份为单位进行聚类，结果见图3。聚类结果表明，当遗传距离为0.05时，陕西省的茶树材料聚为一支，说明陕西省茶树群体具有较高的相似遗传信息，为一个相对独立的资源库；所有茶树材料可以分为6组，其中湖南、安徽和四川3省聚为一组，其余各地各为一组，分别为云南、陕西、湖北、贵州和广西。陕西与湖北两省材料的遗传距离较近。

图3 基于UPGMA的118份茶树资源聚类图Fig.3 Cluster dendrogram of 118 tea resources based on UPGMA method

3 讨 论

3.1 茶树EST-SSR的多态性

随着分子生物学、生物信息学、基因组学的快速发展，分子标记的种类也越来越丰富，除了传统的RAPD、AFLP、RFLP、简单重复序列区间(ISSR)、EST-SSR外，近年来又出现了序列标记位点(STS)、单核苷酸多态性(SNP)、SCoT等分子标记。茶树作为异花授粉的多倍体木本植物，基因组相对比较复杂，随着茶树基因组测序的完成[4,26]，基因组SSR也逐渐被开发[13,27]。本研究中43对EST-SSR引物各项数据均处于理想范围，在118份供试茶树材料中具有高度多态性。本研究中茶树材料平均等位基因数(7.21个)低于Liu等[13]和Shen等[5]报道的基因组SSR(14.9个)和RAPD(9.6个)。PIC值(0.727 2)与Freeman等[20]报道的微卫星平均PIC值(0.748)相当，低于Liu等[13]报道的G-SSR的平均PIC值。由于EST-SSR较为保守，故比基因组G-SSR检测到的多态性低。这与早期的研究结果一致，这些研究表明，在山茶属植物中，基因组SSR标记的多态性具有更高水平[28]。然而，本研究中平均等位基因数高于早期对EST-SSR的研究结果[10,28-29]。这种等位基因数量的差异取决于分离和检测SSR片段的方法差异。本研究选择高分辨率的96通道毛细管电泳全自动核酸分析仪，以取代琼脂糖和丙烯酰胺凝胶来分析茶树SSR，这对提高等位基因多态性有显著贡献；同时也降低了试剂成本，提高了灵敏度和效率，更为重要的是，毛细管电泳提高了实验人员的安全保障[13,17]。目前，毛细管电泳在茶树研究中也得到了一定的应用[13,17,30]。

采用BIOMIGA公司植物基因组DNA提取试剂盒提取茶树基因组DNA。采用琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：1×TAE缓冲液；1.2%琼脂糖凝胶；110 V电压，25 min)检测DNA的纯度和完整性；利用核酸定量仪检测DNA浓度和OD260/OD280值。根据所测的DNA浓度，用ddH2O将DNA样品稀释到约50 ng/μL，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

3.2 陕西省典型茶树群体的遗传多样性

“陕茶1号”是陕西省唯一通过国家品种登记的茶树品种，与陕西丰富的茶树种质资源实际不符，这主要是由于人力和交通的限制，很多资源未能得到很好地挖掘。随着人们对种质资源的认识不断深入，分析手段逐渐更新优化，陕西茶树资源正逐步受到重视并被加以研究利用。从本研究结果来看，陕西省茶树基因遗传多样性H为0.750 4，高于福建、浙江、台湾等地[29]；也高于Yao等[10]研究中中国450个茶树品种的基因多样性(0.64)。另外，陕西茶树资源的PIC值也高于福建、浙江、台湾等省的茶树资源，以及用61个EST-SSR标记测定的印度茶树资源的PIC值(0.497)[28]。本研究结果为陕西省茶树遗传多样性的评价奠定了理论基础，有利于茶树资源进一步的开发利用。

3.3 陕西省茶树资源的评价

陕西茶树资源的历史可以追溯到唐代。陕西茶树资源位处于江北茶区，远离茶树起源地云贵地区[18-19]。此前有关陕西茶树资源的研究，仅涉及极少数陕西茶树资源，且使用的DNA标记相对较少，对陕西茶树资源的认识不够全面。前期本课题组通过资源调查，并利用表型性状评价，得到不同性状的88份茶树资源材料[18-19]。本研究对以上88份陕西茶树资源进行聚类分析显示，同一地区来源的茶树资源多聚类在一起，不同地区的茶树资源也有聚在一起的情况，说明收集的88 份陕西省茶树资源具有相似的遗传背景，这些资源具有相似的起源或经过了更多的遗传交流。但安康市紫阳县城关镇青中村的7号材料与汉中市城固县董家营镇胥家营村的17号材料遗传距离较远；且7和17号材料的茶叶特征性生化成分有较大区别[19]；这2个材料遗传背景差异较大，具有较强的育种潜力。地域聚类分析结果表明，安康市茶树资源与汉中市茶树资源是相互传播的。陕西省所有材料聚类在一起，表明陕西省茶树资源拥有相对独立的遗传背景。陕西省和湖北省两地的茶树资源具有比较亲密的遗传关系，在今后的育种工作中，需要加强陕西茶树资源与外省优良茶树资源的基因交流，以创制新的材料。

定义3 设T={Tk=k:k=1,,n}，其中Tk为得分变量，n为正整数，则称T为离散得分集。假定Tk越大其所对应的主体排序越靠前或越优。

4 结 论

用43对高质量EST-SSR标记发现，陕西省茶树资源遗传多样性较高，并具有相对独立的遗传背景。陕西和湖北两地茶树资源的遗传关系较为亲密，茶树育种从业者可以利用遗传关系较远的茶树进行杂交，以获得优良性状的杂交后代。