贺兰山不同林分凋落物微生物群落特征与影响因素

刘秉儒,张文文,李学斌

1 北方民族大学生物科学与工程学院,银川 750021

2 黄河流域农牧交错区生态保护国家民委重点实验室,银川 750021

3 宁夏特殊生境微生物资源开发与利用重点实验室,银川 750021

4 西北土地退化与生态恢复国家重点实验室培育基地,银川 750021

5 宁夏贺兰山森林生态系统国家定位观测研究站,银川 750021

森林凋落物也称为枯落物(如枯叶、枯枝等),是连接森林地上植被和地下土壤的重要桥梁,在森林植被生长发育过程中起着不可替代的作用[1- 2],驱动生态系统物质循环和能量流动,作为为土壤最有活力的部分,凋落物是土壤养分的主要来源,对气候变化具有极为重要的影响[1,3]。微生物作为凋落物分解过程中最有力的分解者,能将植物中的碳氮磷等养分经分解归还到土壤和大气中去,维持了全球元素的平衡关系,尤其对碳平衡维持贡献巨大[4]。因此森林凋落物及土壤微生物对全球气候变化研究具有重要意义[5-6]。凋落物的微生物群落组成和多样性与土壤环境之间是相互影响的[7],同时也受自身理化因子的约束[8]。研究已表明,微生物群落结构主要受到pH、全氮、有机碳等因子影响[8- 10],有机碳给微生物提供了能源物质[11],而氮的有效性抑制了微生物的生长[12]。林分组成[13]、环境温度[14]、海拔[15]、土壤理化性质[16]等因素均影响凋落物微生物群落及优势菌类。

贺兰山是我国北方重要生态屏障,贺兰山生态森林生态系统具有脆弱性,加强贺兰山的生态保护在我国受到高度重视,在贺兰山这一荒漠绿岛森林生态系统凋落物的研究较少,只有赵晓春对贺兰山典型森林类型凋落物层水文效应进行了研究[17]。由于干旱区和风沙区山地森林系统中针叶树种的枝叶中含有较多的油脂成分,其凋落物中的油脂成分也比较多,这就导致了它的凋落物不易分解,降解速度慢。那么凋落物微生物群落和其他区域的特征是否一致,不同林分凋落物微生物群落特征与影响因素的研究是否支持上述结论,尚未得到验证或揭示。

贺兰山大面积森林类型为针叶林,针阔混交林所占面积较小,其中针叶林为油松林和青海云杉林,针阔混交林以油松-山杨混交林为主要类型。因此,本研究拟以3个典型林分(天然林青海云杉林、油松林和油松-山杨混交林)凋落物为研究对象,分析研究凋落物成分和分解过程中微生物的优势菌类,揭示不同林型的凋落物分解过程中微生物群落结构特征差异、不同凋落物化学组成对微生物群落结构的影响,这对进一步揭示荒漠绿岛生态系统物质循环和能量流动过程,全面理解森林凋落物、土壤养分和微生物之间的互作机理,阐明生物地球化学循环、丰富凋落物分解里具有极其重要的科学意义[16- 18]。

1 试验地概况

研究区地处贺兰山中段东坡苏峪口地段(38°19′—39°22′ N, 105°49′—106°41′ E),该区域森林面积95.87 km2,海拔1500—3000 m之间,属于典型的大陆性气候,秋季凉爽,冬季寒冷漫长,夏季炎热短暂,春季气温回升快,大风及沙尘天气频繁,无霜期60—70 d。年均气温-0.9℃,年均降水量287.2—429.8 mm,主要集中于7—9月。森林土壤类型主要以灰褐土、棕钙土为主。植被类型主要为针叶林、针阔混交林,零星分布的少量的阔叶林,以及高山草甸。针叶林主要有油松 (Pinustabulaeformis)、青海云杉(Piceacrassifolia)；阔叶林主要有山杨(Populusdavidiana)、偶见白桦(BetulaplatypHylla) 和青杨(Populuscathayana)；针阔混交林以油松-山杨混交林最为常见；林下常见灌木植被有小叶忍冬(LoniceramicropHylla)、虎榛子(Ostryopsisdavidiana)、小叶金露梅(Potentillaparifolia)等[16]。

2 研究方法

2.1 样地选择和样品采集

综合考虑宁夏贺兰山森林分布特征和立地条件,以广布的油松林、青海云杉林、油松-山杨混交林作(针-阔混交比例为6∶1)为3种典型林分开展研究,各林分分别确立3块10 m×10 m的样地作为重复,样地相对距离80—100 m之间,对样地经纬度、海拔、坡度、坡向、平均树高、平均胸径、林分密度、郁闭度、主要林下植被和土壤类型等基本特征进行系统调查,各林分生境基本特征见表1,各林分特征及凋落物特征见表2。在每个样地沿两条对角线设置5个样点混合取样法对凋落物层取样,每5个样点采集的未分解凋落物和半分解凋落物的混合后的样品为一个凋落物样品,每个混匀的凋落物在现场等分成两份,一份装入经高温灭菌的冻存管,然后放入冰盒临时保存,回实验室后迅速放入-80℃冰箱,用来测定凋落物中的微生物,一份在室温下自然风干后用于测定凋落物理化指标。

表1 不同林分样地生境基本特征Table 1 Basic habitat characteristics of different stands plots

表2 不同林分及凋落物特征Table 2 Characteristics of different forest stand and litter

2.2 凋落物成分分析方法

对凋落物层的有机碳(OC)、全氮(TN)、全磷(TP)、全钾(TK)进行含量分析,方法如下：SOC测定采用K2Cr2O7容量-外加热法；TN测定采用凯氏定氮法；TP测定采用NaOH碱溶-钼锑抗比色法；TK测定采用火焰光度法,具体方法参见文献[19-20]。

2.3 微生物多样性测定方法

利用高通量基因组测序技术对细菌和真菌多样性进行分析。本研究采用16S rDNA扩增子测序(16S rDNA Amplicon Sequencing)测定细菌多样性[21- 23]。以V4变异区测定细菌群落组成与结构,PCR扩增所用引物分别为806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT)、515F(GTGCCAGCM GCCGCGGTAA)[24- 25]。以常用的核苷酸序列内转录间区(ITS, Internal Transcribed Space)作为真菌分类鉴定依据[25],将ITS1区作为测序区域,PCR扩增所用引物分别为2043R(GCTGCGTTCTTCAT CGATGC)、1737F(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)[25- 26]。将低温保存的新鲜凋落物样品,在无菌环境下用磁珠法提取试剂盒提取样品基因组DNA,操作流程参考文献[24,26]。

无菌水稀释样本DNA至1ng/μL,分别以16S V4区806R和515F为特异引物,ITS1区ITS2- 2043R和ITS5- 1737F为特异引物,PHusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(New England Biolabs 公司)进行PCR扩增。

利用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物浓度后进行等量混样,再使用1×TAE 浓度2%的琼脂糖胶电泳纯化,剪切并回收目标条带(使用Thermo Scientific 公司生产的GeneJET 胶回收试剂盒)[24- 26]。

使用赛默飞世尔公司Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建库试剂盒构建文库,文库经Qubit 定量检测合格,就可用Novogene生物信息技术公司Ion S5TMXL设备开展测序[24- 27]。

2.4 数据处理及作图

用SPSS 21.0进行理化指标数据单因素方差分析、差异显著性用LSD法比较,理化指标的相关性用Pearson相关系数分析,图形制作使用软件Origin 2017[19]。

凋落物样品的有效数据聚类分析使用Uparse软件(v7.0.1001),将序列聚类成为OTUs(Operational Taxonomic Units)时以97%的一致性为依据,然后筛选频数最高的序列作为OTUs代表序列。分别在界(kingdom),门(phylum),纲(class),目(order),科(family),属(genus),种(species)水平上,对OTUs序列进行物种注释,分析各凋落物样本的微生物群落组成[24- 25,27]。

多样性指数Shannon、Chao1、Goods-coverage、PD whole tree使用Qiime软件(Version 1.9.1)计算,绘制稀释曲线用软件Origin 2017,α多样性和β多样性指数组间差异分析使用R软件。多样性指数计算公式如下：

(1)菌群多样性指数(Shannon指数)

式中,ni为微生物群落中物种i的重要值,n为样品中所有物种的重要值之和[17,24]。

(2)菌群丰富度指数(Chao1指数)

式中,Chao1表示预测OTU数目,Sobs为实测OTU数目,F1表示仅出现一条序列的OTU数目,F2表示出现两条序列的OTU数目[24- 26]。

(3)测序深度指数(Goods-coverage指数)

式中,F1表示仅出现一条序列的OTU数目,N是所有OTU丰度之和。根据该公式的含义,Goods-coverage指数越高,则样品中未被测出序列的概率越低[24]。

(4)系统发育多样性指数(PD whole tree指数)

该指数是指所检测的凋落物样本中,物种对进化历史保留的差异[25,27]。因此指数值越大,表明对进化物种保存的差异性越大。

3 结果与分析

3.1 贺兰山不同林分凋落物的微生物OTU分析

贺兰山不同林分凋落物的微生物OTU数据分析表明,油松林凋落物中细菌OTUs数目为2695个,青海云杉林凋落物中细菌OTUs数目为2967个,油松-山杨混交林凋落物中细菌OTUs数目为2286个,其中共有的细菌OTUs数目为1478个,占总数目的37.45%。

贺兰山油松林凋落物中真菌OTUs数目为1243个,青海云杉林凋落物中真菌OTUs数目为1199个,油松-山杨混交林凋落物中真菌OTUs数目为1171个,其中共有的真菌OTUs数目522个,占总数目的24.81%。

贺兰山青海云杉林特有的细菌OTUs数目624个,占总数目的23.15%,特有的真菌OTUs数目366个,占总数的30.53%；天然油松林特有的细菌OTUs数目为577个,占总数的19.45%,特有的真菌OTUs数目422个,占总数的33.95%；油松-山杨混交林特有的细菌OTUs数目385个,占总数目的16.84%,特有的真菌OTUs数目329个,占总数目的28.10%。

3.2 贺兰山不同林分凋落物微生物群落多样性指数分析

利用OTU数目开展细菌和真菌多样性指数的单因素方差分析,结果显示贺兰山不同林分间凋落物的细菌和真菌多样性指数间差异无显著性,但是凋落物的微生物中真菌Ghao1指数(丰度指数)、Shannon指数(多样性指数)均显著小于细菌,凋落物的微生物中真菌PD whole tree指数(系统发育多样性指数)显著大于细菌(见表3)。

表3 不同林分凋落物微生物群落多样性指数分析Table 3 Diversity index of microbial community in litter of different stands

3.3 贺兰山不同林分凋落物微生物群落组成分析

在各分类水平上检测3种林分凋落物的微生物群落组成,检测到细菌门33个,纲41个,目89个,科169个,属377个；检测出真菌门7个,纲33个,目61个,科108个,属142个。凋落物的微生物组成在不同林分间差异较小,但是细菌群落组成的数量在各分类水平上均显著高于真菌群落组成数量,并且在门水平、属水平上差异极显著。细菌、真菌群落组成在各个分类水平上均表现为：油松-山杨混交林<油松林<青海云杉林(表4),说明在3种林分中青海云杉林凋落物的微生物多样性最丰富。

表4 不同林分凋落物的微生物群落结构Table 4 Microbial community structure of litter in different stands

门水平不同林分凋落物微生物优势菌群的差异表明,不同林分凋落物的微生物中细菌门类前十的丰度基本相同(图1),优势菌门为放线菌门(Actinobacteria)26.6%、变形菌门(Proteobacteria)45.55%、酸杆菌门(Acidobacteria)2.76%、拟杆菌门(Bacteroidetes)19.97%、共占94.88%。油松林凋落物的细菌优势门类中绿弯菌门变形菌门的丰度占比较高,青海云杉林凋落物的微生物中细菌门类的酸杆菌门丰度占比较高,针阔混交林凋落物的微生物中放线菌门在中丰度占比较高。相比而言,检测到的真菌门类较少(表5),仅占到30%左右,在3种林分凋落物的微生物中真菌主要存在于子囊菌门(Ascomycota)29.68%、球囊菌门(Glomeromycota)0.006%、壶菌门(Chytridiomycota)0.004%、毛霉菌门(Mucoromycota)0.019%。子囊菌门(Ascomycota)是贺兰山3种林分的凋落物中最具优势菌门,而且显著高于其余菌门。同时也发现,枝霉门(Blastocladiomycota)是油松-山杨混交林凋落物的特有菌门,隐真菌门(Rozellomycota)是青海云杉林和油松-山杨混交林凋落物的特有菌门。

图1 不同林分凋落物细菌群落丰度前十的细菌门Fig.1 The top ten bacterial phylum of bacteria Community abundance in different forest litters HY:天然油松林 Pinus tabulaeformis forest；HS：青海云杉林Picea crassifolia forest ；HJ：油松-山杨混交林 Mixed forest of Pinus tabulaeformis and Populus davidiana

表5 不同林分凋落物真菌群落丰度前十的细菌门占比/%Table 5 The proportion of bacteria in the top ten of Fungi Community abundance in different forest stands

在属水平分析不同林分凋落物微生物优势菌群的差异表明,细菌属丰度占比前十的有结核菌属(Mycobacterium)、鲸杆菌属(Cetobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(SpHingomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、薄层菌属(Hymenobacter)、unidentified_Burkholderiaceae菌属、地杆菌属(Pedobacter)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、成对杆菌属(Dyadobacter)、内诺卡菌属(Nocardioides),其中薄层菌属、甲基杆菌属、地杆菌属、内诺卡菌属、鞘氨醇单胞菌属、unidentified_Burkholderiaceae菌属为较具优势菌种,在不同林分间上述优势菌属占比差异显著(P<0.05)。在油松林中鞘氨醇单胞菌属、薄层菌属、甲基杆菌属、unidentified_Burkholderiaceae菌属丰度占比最高,但是在青海云杉林凋落物中丰度占比最小；青海云杉林凋落物中特有的优势菌属是地杆菌属,油松-山杨混交林凋落物中内诺卡菌属和结核菌属丰度占比最大(图2)。

不同林分间凋落物的微生物中,真菌群落丰度前十的占比差异较大,数据表明(图2),油松山杨混交林20.59%、青海云杉林16.63%、油松林1.99%。青海云杉林凋落物中裸盖菇菌属(Psilocybe)占比13.22%、白僵菌属(Beauveria)占比3.08%,这两种菌属是极具优势均属；油松林凋落物中肉片齿菌属 (Sistotrema)占比1.34%、Desmazierella占比 0.12%、丝盖伞属 (Inocybe)占比0.16%,这3种菌属是极具优势均属；油松-山杨混交林凋落物中Desmazierella (占比20.17%)为极具优势菌属。

图2 不同林分凋落物微生物群落丰度前十的菌属Fig.2 The top ten species of microbial community abundance in different forest litters

3.4 贺兰山不同林分凋落物化学成分与组分分析

数据分析表明,贺兰山林分凋落物的化学成分与组分均存在差异(表6)。有机碳(OC)是凋落物化学组成的主要成分,3种林分中油松林凋落物OC含量占比达到36%,其它化学组分(TN、TK、TP)占总质量的比值较小(均小于1%),并表现为TN>TK>TP,油松林凋落物C/N、C/P高于其余两种林分的凋落物,且差异显著。综合来看,OC、TN、TK分别在油松林、油松-山杨混交林、青海云杉林凋落物中含量最高,且具差异显著性,青海云杉林凋落物N/P低于其余两种林分凋落物,且差异显著。

表6 不同林分的凋落物化学成分及组成Table 6 Chemical composition characteristics of litter in different stands

3.5 贺兰山不同林分凋落物微生物群落组成与环境因子的相关性

贺兰山3种林分凋落物的化学成分与细菌群落组成的Spearman相关性分析表明,在各分类水平丰度前10、丰度前35进行比较,然后在分析结果中再次对丰度前35的属水平上具有显著相关性的数据进行分析。结果表明(图3),凋落物OC与苯基杆菌属(PHenylobacterium)和、Iamia显著正相关,凋落物OC与丙酸杆菌亚属(Friedmanniella)、黄杆菌属(Flavobacterium)、成对杆菌属(Dyadobacter)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、Massilia、Mucilaginibacter、unidentified_Burkholderiaceae具有显著或极显著负相关性；凋落物TN与苯基杆菌属(PHenylobacterium)具有显著正相关性,凋落物TN与黄杆菌属(Flavobacterium)、TardipHaga、Mucilaginibacter、unidentified_Rhizobiaceae具有显著或极显著负相关性；凋落物TK与黄杆菌属(Flavobacterium)具有显著正相关,与短单胞菌属(Brevundimonas)具有极显著正相关性。凋落物TP与短单胞菌属(Brevundimonas)具有极显著正相关性。

图3 不同林分凋落物细菌群落属水平与环境因子的相关性分析Fig.3 Correlation analysis between bacterial community and environmental factors in different forest litters图中*表示显著相关性(P<0.05),**表示极显著相关性(P<0.01)；OC：凋落物有机碳、TN：落物全氮、TP：凋落物全磷、TK：凋落物全钾

贺兰山不同林分凋落物的化学成分与凋落物的微生物真菌群落组成,丰度前35的Spearman相关性分析结果表明(见图4),凋落物OC与丝核菌属(Oliveonia)、真菌属(Serendipita)、Condylospora、Desmazierella、Yamadamyces具显著或极显著负相关性；凋落物TN与丝核菌属(Oliveonia)、真菌属(Serendipita)、蔓毛壳属(Herpotrichia)、盘双端毛孢属(Seimatosporium)、Condylospora具显著或极显著负相关性；凋落物TP与黑星菌属(Venturia)、蜡壳菌属(Sebacina)、Menisporopsis具显著或极显著正相关性,与散斑菌属(LopHodermium)、Knufia、肉片齿菌属(Sistotrema)具极显著负相关性(P<0.01)；凋落物TK与蔓毛壳属(Herpotrichia)、丝核菌属(Oliveonia)、Condylospora具显著或极显著负相关性,与散斑菌属(LopHodermium)、Knufia具显著负相关性(P<0.01)。

图4 不同林分凋落物真菌群落属水平与环境因子相关性分析Fig.4 Correlation analysis between the level of Fungi Community and environmental factors in different forest litters图中*表示具显著相关性(P<0.05),**表示具极显著相关性(P<0.01)

3.6 贺兰山不同林分凋落物微生物多样性指数和环境因子冗余分析

贺兰山油松林和油松-山杨混交林凋落物的微生物多样性指数分别受TN和TK影响较大(图5),青海云杉林凋落物的微生物多样性主要受凋落物OC和TP含量的影响。综合分析表明,贺兰山不同林分凋落物OC对细菌和真菌多样性指数影响最为显著(P=0.01、P=0.002)(见图5)。

图5 不同林分凋落物中微生物多样性指数和环境因子间冗余分析Fig.5 Redundancy analysis between microbial diversity index and environmental factors of different forest stands

3.7 贺兰山不同林分凋落物微生物生态网络分析

生态网络可视化图可显示各物种之间的相互关系,贺兰山不同林分凋落物的细菌生态网络图表明(图6),油松林凋落物中具有最高连接度的细菌为OTU_110(变形菌门)、OTU_109(放线菌门)真菌为OTU_207(未分类)、OTU_24(未分类)。青海云杉林凋落物中细菌OTU_109(放线菌门)、OTU_1(变形菌门)具有最高连接度,真菌OTU_330(担子菌门)、OTU_4490(未分类)。油松山杨混交林凋落物的微生物中,具有最高连接度的细菌为OTU_1076(放线菌门)、OTU_4(变形菌门),真菌为OTU_288(未分类)、OTU_10(子囊菌门)。不同林分网络节点间连接线正负相关比接近1,但是细菌节点间连接线负相关比例略大于正相关(图6),而真菌则相反(图7)。

图6 不同林分凋落物细菌生态网络图Fig.6 Bacterial ecological network diagram of litter in different forests

图7 不同林分凋落物真菌生态网络图Fig.7 Ecological network map of litter fungi in different forest stands

4 讨论

许多学者研究表明,凋落物的细菌优势菌门为放线菌门、变形菌门、酸杆菌门和拟杆菌门,本研究中,贺兰山3种林分的这四类细菌优势菌门占细菌总丰度达到90%以上,与学者们的研究结论一致[28--31],贺兰山凋落物中真菌优势菌门与其他区域森林凋落物中优势真菌门类群基本保持一致[32],但是在不同林分间凋落物的细菌和真菌各优势菌门变化幅度较小,这说明凋落物的微生物群落多样性指数在不同林分间均无显著性差异,这与当前许多研究结果并不相同[32- 34]。贺兰山林区以青海云杉林和油松林作为相对稳定的森林类型,青海云杉林具有长期郁闭、死地被物层厚等特点,其他树种不易侵入,是相对稳定的林分[16]。油松林由于其耐旱及抵抗力较强的特点,在其它树种不易生长的贫瘠坡地上,稳定性也高。因此,贺兰山森林植物物种多样性偏低,枯落物来源单一,其成分绝大多数是油松、云杉的叶片凋落物。这表明林分特征没有显著影响凋落物微生物多样性和群落结构。

林下凋落物的分解过程是养分释放过程[35],不同林分凋落物因种类和质量有差别,引起凋落物的分解速率不同,由此导致不同林分土壤OC等含量不同[14-15,28]。已有研究表明,凋落物有机碳含量与温度呈正相关,与海拔梯度呈相关[13,35]。本研究揭示贺兰山3种林分凋落物OC变化规律为油松林>针阔混交林>青海云杉林。这与贺兰山3种林分分布沿海拔梯度分布规律一致,3种林分凋落物OC含量随着海拔的升高依次递减。

细菌网络中核心节点大多属于变形菌门和放线菌门和拟杆菌门,真菌的核心节点则大多属于子囊菌门和担子菌,同时这几类细菌和真菌在群落中相对丰度最高,这表明这几类细菌和真菌在凋落物中占有优势地位,对贺兰山凋落物环境具有较强的适应性。此外真菌网络中的许多核心节点,目前并无分类,却在微生物网络的构建中发挥重要作用,将是下一步深入研究的重点。

微生物生态网络中的正相关边代表生态位一致或共生关系[36],而负相关意味着生态位不同或竞争关系[37]。本研究揭示真菌间连线负相关数量略大于正相关,细菌则相反。这是由于真菌个体数量少,个体较大,生长速度较细菌慢,并且很多种类真菌可以在油松和青海云杉根部形成外生菌根,因此生态位不易重叠,在生态网络中负相关比例较大[38]。反之细菌个体较小,数量多,生态位容易重叠,因此正相关比例较大。

许多研究揭示pH、TN和SOC等环境因子对微生物群落结构影响较大[7-10],而TN有效性对微生物生长有抑制作用[12],本研究证明凋落物TN与多数细菌和全部真菌属具有显著或极显著的负相关关系,对微生物的生长具有明显抑制作用。

5 结论

贺兰山3种代表性林分天然油松林、青海云杉林以及油松与山杨混交林凋落物的细菌、真菌多样性指数之间差异性均不显著,在多样性指数中真菌PD whole tree指数显著大于细菌,真菌Shannon指数与Ghao1指数却显著小于细菌。

在门水平上贺兰山不同林分凋落物的微生物优势菌类差异不显著,但在属水平上差异显著,而且细菌差异小于真菌,在各个分类水平上,凋落物细菌和真菌群落组成均表现为油松-山杨混交林<青海云杉林<青海云杉林,说明3种林分凋落物微生物多样性在青海云杉林中最为丰富。

贺兰山油松林与油松-山杨混交林的微生物生态网络较复杂,细菌变形菌门、放线菌门和拟杆菌门,真菌子囊菌门和担子菌,对凋落物环境更适应,对于维持微生物群落的稳定性具有重要作用。

油松林凋落物的OC含量最大、青海云杉林凋落物的TK含量最大、针阔混交林凋落物的TN含量最大,且在贺兰山3种林分中差异显著,而油松林凋落物的C/N、C/P显著高于其他两种林分的凋落物,青海云杉林凋落物N/P显著小于其他两种林分的凋落物,青海云杉林凋落物N、P含量差异最小。贺兰山3种林分凋落物TN与多数细菌和全部真菌属具显著或极显著负相关性,对微生物的生长具有明显抑制作用,凋落物OC、TN、TP、TK是影响微生物群落组成和多样性的重要因素,其中OC与微生物群落多样性相关性最显著,是影响凋落物细菌和真菌群落组成和多样性最主要的因子。