口蹄疫O型、A型二价3B蛋白表位缺失灭活疫苗免疫安全性和抗体消长规律研究

徐小艳 陈昌海梁永晔王相子 陈培华开 妍 邱 冬

（1江苏省动物疫病预防控制中心，江苏南京 210036；2宝应县畜牧兽医站，江苏扬州 225800）

口蹄疫是目前对养猪业危害较严重的一种传染病。一直以来，我国对口蹄疫防控都实施强制免疫策略，选用口蹄疫灭活疫苗对猪只进行免疫预防。已发表的研究结果[1]表明，若口蹄疫疫苗中含有残留的微量非结构蛋白，能诱导动物机体产生特异性抗体，特别是重复注射疫苗后尤为明显。因此，使用口蹄疫传统灭活疫苗对口蹄疫的诊断、检疫存在很大的干扰作用，是阻碍我国口蹄疫净化和建立口蹄疫无疫区的重要原因之一。本研究选用的口蹄疫O型、A型二价3B蛋白表位缺失灭活疫苗，因缺失了口蹄疫病毒非结构蛋白主要优势表位3B基因，疫苗中不存在非结构蛋白优势表位3B，免疫动物后，不产生口蹄疫非结构蛋白抗体，通过非结构蛋白抗体检测，可有效区分自然感染和注射疫苗动物，可为口蹄疫的疫病净化提供有效的技术手段。通过对口蹄疫O型、A型二价3B蛋白表位缺失灭活疫苗（O/rV-1株+A/rV-2株）免疫安全性和抗体消长规律的研究，评估其安全性和诱导产生的抗体水平，可为临床应用口蹄疫疫苗提供新选择，为口蹄疫疫病综合防控和净化提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验猪

选取江苏省扬州市某生猪养殖场45日龄仔猪50头。猪群健康，生长良好，试验前，所有仔猪均未免疫任何口蹄疫疫苗。

1.1.2 疫苗

口蹄疫O型、A型二价3B蛋白表位缺失灭活疫苗（O/rV-1株+A/rV-2株），中牧实业股份有限公司提供，批号1909001。

1.1.3 检测试剂

猪口蹄疫病毒非结构蛋白合成肽ELISA抗体检测试剂盒，购自中牧实业股份有限公司，批号ZM2019001；口蹄疫病毒A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒，购自中国农业科学院兰州兽医研究所，批号20191202103-1；口蹄疫病毒O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒，购自中国农业科学院兰州兽医研究所，批号202004011 01-2。

1.2 方法

1.2.1 免疫与样品采集

⑴试验分组。50头仔猪随机分为2组，分别为：一免组，25头，只进行一次免疫；二免组：25头，一免后31 d进行一次加强免疫（二免）。

⑵免疫剂量与途径。免疫剂量为2 mL/头，颈部肌肉注射。

⑶疫苗注射与样品采集。一免前采血与一免：一免前进行第1次采血，随机采集15头猪血样（覆盖一免组和二免组）并分离血清，冻存。参考猪场口蹄疫疫苗的原有免疫程序，一免时间选定在45日龄，对一免组和二免组共50头仔猪实施免疫。

一免后采样：一免后29 d，随机采集15头猪血样（覆盖一免组和二免组）并分离血清，冻存；一免后61 d、95 d、123 d，分别对一免组试验猪进行采样，每次随机采集15头猪血样并分离血清，冻存。

二免：二免组试验猪在一免后31 d加强免疫1次。

二免后采样：二免后30 d、64 d、92 d，分别对二免组试验猪进行采样，每次随机采集15头猪血样并分离血清，冻存。

1.2.2 免疫安全性观察

所有试验猪每次免疫后就地观察2 h，如无异常症状，则由畜主管理并继续观察，免疫后48 h内回访1次。试验期间，不定期到场观察。

1.2.3 抗体检测

⑴非结构蛋白抗体，采用猪口蹄疫病毒非结构蛋白合成肽ELISA抗体检测试剂盒检测口蹄疫非结构蛋白抗体，按照试剂盒说明书进行操作。

⑵结构蛋白抗体，采用口蹄疫病毒A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测A型口蹄疫抗体，采用口蹄疫病毒O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测O型口蹄疫抗体。按照试剂盒说明书进行操作，每块酶标板检测10份样品，采用Log10（效价）表示定量检测结果。

1.2.4 结果判定

口蹄疫非结构蛋白抗体：血清OD450nm值＜临界值，判为阴性；血清OD450nm值≥临界值，判为阳性。

A型口蹄疫抗体、O型口蹄疫抗体：血清Log10（效价）＜1.8，判为阴性；血清Log10（效价）≥1.8，判为阳性。

2 结果

2.1 免疫安全性试验结果

观察猪只精神状态、采食量、粪便、尿液以及猪群的发病和死亡情况，试验期间未发现猪只精神状态、采食量、粪便、尿液等出现异常情况，试验猪群未发病、死亡。

2.2 抗体检测结果

试验期间，不同时间点各组实际采集样品数为14～16份/次，共采集并检测猪血清130份，检测结果见表1。

表1 试验猪群抗体检测结果

3 讨论

3.1 免疫安全性

试验猪群未发现异常情况，表明口蹄疫O型、A型二价3B蛋白表位缺失灭活疫苗（O/rV-1株+A/rV-2株）对仔猪群进行免疫是安全的。

3.2 非结构蛋白抗体

免疫前后，猪群口蹄疫非结构蛋白抗体检测结果均为阴性，说明疫苗免疫后未产生非结构蛋白抗体，猪群也未感染口蹄疫病毒而产生感染抗体。因此，该疫苗的应用可以有效解决口蹄疫疫病监测和诊断中无法有效区分感染抗体和免疫抗体的难题，为该病的净化工作提供技术手段，可以大大缩短净化周期，提高净化实效。

3.3 A型和O型口蹄疫抗体消长规律

从A型和O型口蹄疫抗体阳性率来看，免疫前，分别为7.14%和0；一免后29 d、61 d、95 d、123 d，二免后30 d、64 d、92 d，均为100%。从A型和O型口蹄疫抗体Log10（效价）均值来看，免疫前，该指标数值分别为0.86和0.75，低于判定阳性临界值1.8；一免后29 d、61 d、95 d、123 d，二免后30 d、64 d、92 d，该数值均远大于1.8。从A型和O型口蹄疫抗体Log10（效价）标准差来看，本研究中涉及的各个时间点，该指标数值均较小，说明个体之间抗体水平差异小，疫苗免疫整齐度高。

4 结论

用口蹄疫O型、A型二价3B蛋白表位缺失灭活疫苗对仔猪进行一次免疫，免疫后29 d，A型和O型口蹄疫抗体阳性率迅速上升至100%，且维持在高水平（100%）的时间可达4个月；进行二次免疫，二免后30天，A型和O型口蹄疫抗体阳性率为100%，且维持在高水平（100%）的时间约3个月，可为该病的综合防控提供有效的疫苗产品。

该疫苗不仅可以免疫预防猪O型口蹄疫，还可以免疫预防猪A型口蹄疫，因而解决了生猪生产中存在的猪免疫牛羊口蹄疫灭活疫苗[2-5]的问题，为口蹄疫疫苗的科学合理使用提供了新选择。