胆碱激酶α在不同级别胶质瘤中的表达差异及临床意义

黄 灵，邹有瑞，马 悦，李琢琦，高鑫义，阿布拉古，马 辉

1.宁夏医科大学临床医学院，宁夏 银川 750004；

2.宁夏医科大学总医院神经外科，宁夏 银川 750004；

脑胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤［1］，生长速度快，浸润能力强［2］。胆碱激酶α（choline kinase alpha，CHKα）在多种肿瘤中高表达［3-6］，但是CHKα在胶质瘤中的作用，特别是对患者生存的影响鲜见报道。本研究采用免疫组织化学染色的方法观察不同级别胶质瘤组织中CHKα蛋白的表达情况，并采用生物信息数据库中的相关临床数据分析对临床病例结果进行验证，初步探索CHKα在不同级别胶质瘤中表达的临床病理学意义及其预后判断价值。

1 资料和方法

1.1 研究对象

回顾并分析宁夏医科大学总医院神经外科2017年1月—2019年12月收治的120例胶质瘤患者的临床病理学资料。根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）分级标准将肿瘤分为Ⅰ～Ⅳ级。120例患者中，男性61例（50.8%），女性59例（49.2%），年龄4～77岁，中位年龄（47.75±17.29）岁。本研究经宁夏医科大学伦理委员会批准。纳入标准：①接受根治性外科手术切除治疗；② 术后病理学确诊；③术前未接受任何放化疗；④ 无内脏器官器质性病变及功能异常；⑤ 血、尿、粪、肝、肾、心功能检查无异常。排除标准：①复发性胶质瘤；②合并其他恶性肿瘤；③术前有接受化疗和（或）放疗病史；④ 接受分子靶向药物治疗病史。

1.2 免疫组织化学法检测胶质瘤组织中CHKα蛋白的水平

将手术切除的胶质瘤组织经3.7%甲醛溶液进行常规固定、脱水，包埋并切成4 μm的切片行H-E染色。根据免疫组织化学法实验步骤进行脱蜡、常规抗原修复后，使用封闭液封闭2 h，加入CHKα抗体（兔抗人CHKα，英国Abcam公司，稀释比为1∶200）温育2 h，使用PBS洗净后加入相应种属二抗（工作液购自北京中杉金桥生物技术有限公司）。加入DAB显色液及苏木精常规复染后，进行封片、干燥，观察CHKα蛋白的表达情况。本次实验采用EnVision二步法进行染色。CHKα以细胞质棕黄色为阳性。

1.3 免疫组织化学判读标准

所有病理组织切片由2位病理科医师双盲阅片。使用Capture 2.1显微镜图片采集软件选择染色均匀且不相邻的3个高倍视野（×400）进行拍照，按照阳色细胞所占百分比及显色强度作为判别依据，CHKα蛋白以细胞质内呈现棕黄色颗粒为阳性显色。计数在该视野下的阳性细胞数并计算阳性细胞的占比取平均值。

1.4 随访

对所选患者进行术后电话随访。随访内容包括患者的睡眠、饮食、是否转移复发、是否有新的并发症等。患者生存时间为入院经手术后病理学检查确诊时间，终点时间为随访时死亡或终止观察的时间，若患者因胶质瘤导致相关死亡，则随访终止。

1.5 生物信息学数据库及方法

使用在线数据分析CHKα在不同级别脑胶质瘤中的表达情况，利用UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/）分析已公开数据库中CHKα在高低分化的脑胶质瘤中的表达，下载相关数据进行生存分析。

1.6 统计学处理

采用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析。用χ2检验分析CHKα在不同级别胶质瘤中的表达差异与预后的关系，总的生存时间为终点时间与起始时间之差，采用单因素分析影响胶质瘤预后相关的危险因素，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线并进行生存分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床病理学特征

高、低级别胶质瘤患者吸烟与不吸烟例数分别为18例（15.0%）和102例（85.0%）。高级别胶质瘤患者死亡54例，存活2例；低级别胶质瘤患者死亡6例，存活48例。高级别胶质瘤患者发病年龄为（58.17±12.14）岁。低级别胶质瘤患者发病年龄为（38.07±16.21）岁。胶质瘤主要位于幕上，分别为额叶46例（38.3%）、颞叶36例（30.0%）、顶叶14例（11.7%）、枕叶10例（8.3%）、其他14例（11.7%），肿瘤直径（45.78±15.63）mm，平均直径45.78 mm。根据2016年WHO修订版胶质瘤分类标准，其中Ⅰ/Ⅱ级58例（48.3%），Ⅲ/Ⅳ级62例（51.7%），具体结果见表1。

表1 影响120例胶质瘤患者预后的单因素分析Tab.1 Analysis of single factor affecting the prognosis of 120 glioma patients［n (%)］

2.2 免疫组织化学CHKα蛋白检测结果

本次免疫组织化学染色共检测胶质瘤标本109例（90.8%）。结果发现，CHKα蛋白定位于细胞质内，在Ⅰ～Ⅳ级胶质瘤中CHKα的表达率分别为9.77%、7.81%、95.03%和92.90%。CHKα蛋白在高、低级别胶质瘤组织中的表达差异有统计学意义（P＜0.01）。根据2016年WHO修订版的胶质瘤诊断标准，病理学检查结果显示，CHKα蛋白平均表达率在毛细胞型星形细胞瘤为9.80%，弥漫性星形细胞瘤为7.80%，间变型星形细胞瘤为95.15%，多形性胶质母细胞瘤为93.10%（表2）。经计数表达CHKα蛋白胶质瘤细胞在总体细胞中的占比后可知，CHKα蛋白在高级别胶质瘤中的表达明显高于低级别胶质瘤细胞（P＜0.05，表2，图1）。

表2 CHKα表达量与临床病理学特征的关系Tab.2 Relationship between CHKα expression and clinicopathological features

图1 病理学诊断结果Fig.1 The pathological diagnosis

2.3 随访情况

截至2021年6月30日，在120例患者中，失访10例，随访率为91.67%，死亡60例。

2.4 预后及Kaplan-Meier生存曲线分析

高级别胶质瘤患者主要并发症为原位肿瘤复发、癫痫及颅内囊性实变。低级别胶质瘤患者并发症主要为原位肿瘤复发及癫痫。χ2检验结果显示，患者的死亡风险因CHKα表达量、肿瘤直径、患者年龄、胶质瘤级别的不同而异（P＜0.01，表1）。单因素分析结果显示，不同的病理学分级、年龄、肿瘤直径的胶质瘤患者术后总生存期差异有统计学意义（P＜0.05）。性别、肿瘤位置、吸烟对胶质瘤患者术后总生存期的影响不大，差异无统计学意义（P＞0.05）。

我们进一步根据CHKα蛋白的表达情况及患者的生存时间，绘制Kaplan-Meier生存曲线。CHKα低表达患者总生存期较CHKα高表达患者长，差异有统计学意义（P=0.009，图2）。

图2 CHKα表达量不同的胶质瘤患者的生存曲线Fig.2 The survival curves of glioma patients with different CHKα expressions

2.5 生物信息学分析结果

应用UALCAN在线工具对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中不同级别脑胶质瘤中CHKα表达水平进行比较，下载TCGA部分转录组表达数据并进行生存分析。结果显示，CHKα在高级别胶质瘤中的表达显著升高，CHKα表达差异与脑胶质瘤患者生存率呈正相关（P＜0.001，图3）。

图3 TCGA 转录组测序数据分析结果Fig.3 Analysis of TCGA transcriptome sequencing data

3 讨 论

胶质瘤是颅内最常见的原发性脑肿瘤，发病因素与遗传和环境密切相关，约占颅内恶性肿瘤的80%［7］，其恶性程度与病理学分级密切相关，病理学分级越高，恶性程度就越高［8］。因肿瘤的生长方式主要是浸润性生长，因此具有侵袭性强、复发率高、预后差的特点［9-11］，这给胶质瘤患者的治疗带来了极大的困难［12-13］。本研究观察了CHKα蛋白在不同级别胶质瘤患者肿瘤组织中的表达水平。本课题组采用免疫组织化学染色检查，结果显示，在弥漫性星形细胞瘤与少突胶质瘤及同级别之间的各亚型的胶质瘤CHKα的表达差异无统计学意义，因此，在各级别胶质瘤中我们只选取了一种类型的胶质瘤作为本次研究对象。本研究结果显示，CHKα蛋白在高级别患者胶质瘤中相对表达量明显高于低级别的胶质瘤组织。本研究进一步分析了CHKα蛋白表达水平与性别、年龄、WHO分级、肿瘤直径等临床病理学参数之间的关系。结果显示，CHKα蛋白的表达与肿瘤直径、年龄、胶质瘤级别密切相关，肿瘤直径≥6.0 mm、WHO为Ⅲ或Ⅳ级、年龄＞65岁胶质瘤患者肿瘤组织中CHKα蛋白表达率明显要高于肿瘤大小＜6.0 cm、WHOⅠ或Ⅱ级、年龄＜65岁脑胶质瘤患者的肿瘤组织中CHKα蛋白的表达量。

TCGA为目前全球肿瘤数据收集最全面、最规范的数据库［14-15］。本研究依托患者病历数据库并结合相关的实验，与TCGA数据库中的数据进行对比，结果显示高表达CHKα蛋白的患者总体生存期更短，提示CHKα为脑胶质瘤的不良预后因子，与本研究结果一致。

有研究［16］报道，CHKα蛋白的高表达与肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移等过程密切相关。Hu等［17］的研究结果显示，CHKα过表达能够促进消化系统肿瘤的转移及增加不良预后的风险。Ramírez de Molina等［18］的研究发现，CHKα高表达可增加肺癌患者的复发和死亡风险。CHKα蛋白的高表达对胶质瘤患者预后的影响及机制仍然不清。有研究［19］报道，CHKα能够催化磷脂酰胆碱的生成，同时在二磷酸胞嘧啶胆碱的合成途径中参与磷脂酰胆碱和其他膜磷脂的合成。单因素分析发现，CHKα蛋白过表达多发生于高级别胶质母细胞瘤，而在星形细胞瘤（Ⅰ级）、毛细胞型星形细胞瘤（Ⅰ级）却不常见。生存分析结果还提示，CHKα高表达的患者生存率明显低于CHKα低表达的患者（P＜0.05），这可能与胶质瘤内部肿瘤细胞的异质性有关［20］，其肿瘤细胞外部形态与患者预后可能存在相关关系［21］。高级别胶质瘤包括WHO Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤［22］，其治疗的方式通常是术中全切联合术后放化疗［23-25］。尽管临床上对于高级别胶质瘤的治疗方案有多种，但患者的治疗效果仍然不理想，术后复发率仍较高［26-27］。预测复发时间（time to occurrence，TTR）对治疗高级别胶质瘤具有重要的指导意义。然而，许多患者发现有症状或确诊时基本已处于中晚期或肿瘤已经向周围浸润性生长而手术难以达到彻底切除。因此，早期检测和较为准确地发现胶质瘤患者对改善患者预后至关重要。目前国内外关于CHKα蛋白在胶质瘤中的作用及对患者预后的影响研究甚少，加之临床病例样本有限，与患者预后的关系可能还不像其他的特异性分子那样明确。本研究以2017年1月—2019年12月经手术治疗的胶质瘤患者为研究对象，因此本次研究使用的是2016年WHO胶质瘤分类指南作为诊断标准。2021年版WHO胶质瘤分类指南与2016年版指南相比，诊断标准的主要区别是在儿童胶质瘤中增加了MYB或MYBL1和MAPK基因突变，在高级别胶质瘤中则增加了H3K27、H3G34、H3及IDH突变。在成人胶质瘤的病理学诊断上基本维持了2016年版的诊断标准。因在胶质瘤内部肿瘤细胞的异质性，病理学诊断往往以在该视野条件下占比较多的细胞作为诊断依据。因此，2021年的WHO胶质瘤分类指南的诊断标准不会对本研究结果造成明显的影响。

综上所述，CHKα蛋白在胶质瘤组织中呈高表达状态，其高表达水平与胶质瘤大小、病理学分期有关。CHKα蛋白表达的高低与胶质瘤患者的生存率有着密切的关系。因此，检测CHKα在胶质瘤中的表达可作为判断胶质瘤患者的预后的指标之一。