喉癌组织中ATF4、RPL41表达变化及意义

要兆旭，彭丽娜，马海斌

邯郸市中心医院耳鼻喉科，河北邯郸056000

2018 年全球喉癌的新发、死亡病例数约为17.7万人、9.5 万人，严重影响公众生命健康［2］。喉癌早期临床症状隐匿，大多数患者确诊时处于晚期，错失最佳治疗时机，导致患者预后不理想。提高喉癌早期检出率对降低喉癌病死率具有重要意义［3］。转录激活因子4（ATF4）是线粒体应激调控的重要蛋白，参与氧化应激、糖代谢等过程，其异常高表达与乳腺癌、前列腺癌侵袭和转移密切相关［4-5］。核糖体蛋白L41（RPL41）属于核糖体蛋白家族成员，在蛋白质折叠和蛋白质翻译后修饰中起调节作用。在宫颈癌和肝内胆管癌中RPL41 表达异常，并且与宫颈癌和肝内胆管癌患者不良预后密切相关［6-7］。本研究观察喉癌组织中ATF4 与RPL4 的表达变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集 2012 年 4 月—2016 年 4 月本院诊治的喉癌患者120 例，纳入标准：初诊，经病理学检查确诊；临床病理资料完整；无放化疗治疗史。排除标准：合并其他器官恶性肿瘤；肝肾功能障碍；全身性感染性疾病；喉癌复发。患者男69 例，女51例；年龄45～78（63.81 ± 12.49）岁；声门上型70 例，声门型50 例；肿瘤组织低分化34 例，中高分化86例；有淋巴结转移45 例，无淋巴结转移75 例；TNM分期Ⅰ、Ⅱ期81 例，Ⅲ期39 例。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。患者均签署知情同意书。

1.2 喉癌组织及其癌旁组织中ATF4、RPL41 蛋白表达检测 采用免疫组化法。收集术中切除的喉癌组织及其癌旁组织（距肿瘤组织边缘＞3 cm），用中性甲醛固定，乙醇梯度脱水，生物组织包埋机进行石蜡包埋；脱蜡水化，置于37 ℃湿盒，3%H2O2孵育20 min，高压锅抗原修复，封闭液于37 ℃孵育0.5 h；滴加Anti-ATF4抗体或Anti-RPL41抗体（Abcam生物科技有限公司，稀释比例1∶300），24 h后加二抗（艾美捷科技有限公司，稀释比例1∶500），37 ℃孵育0.5 h；DAB 法显色，苏木精复染、脱水、透明和固定，倒置生物显微镜（×400，美国赛默飞公司），观察染色结果。

结果判定：阳性细胞百分比≤5%计0 分，5%＜阳性细胞百分比＜25%计1 分，25%≤阳性细胞百分比＜50%计2 分，50%≤阳性细胞百分比＜75%计3 分，阳性细胞百分比≥75%计4 分；染色强度无色计0 分，淡黄色计1 分，棕黄色计2 分，棕褐色计3 分。以上两项评分乘积0～4为阴性，5～12为阳性［8］。

1.3 随访 以患者出院为起点，采用电话、门诊复查等方式进行随访，随访60 个月或复发、死亡时随访结束。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。计数资料比较采用χ2检验，ATF4蛋白与RPL41蛋白表达的相关性用Spearman 法进行分析，ATF4 蛋白与RPL41 蛋白表达与预后的关系用Kaplan-Meier 法进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 喉癌组织及其癌旁组织中ATF4、RPL41 蛋白表达比较 喉癌组织及其癌旁组织中ATF4 蛋白阳性表达率分别为 75.83%（91/120）、20.00%（20/120），RPL41 蛋白阳性表达率分别为 26.67%（32/120）、79.17%（95/120）。与癌旁组织比较，喉癌组织中ATF4蛋白阳性表达率高，RPL41蛋白阳性表达率低（P均＜0.05）。

2.2 喉癌组织中ATF4 蛋白与RPL41 蛋白表达的相关性 喉癌组织中ATF4 蛋白与RPL41 蛋白表达呈负相关（rs=-0.809，P＜0.05）。

2.3 ATF4、RPL41 蛋白表达与喉癌患者临床病理特征的关系 ATF4蛋白阳性表达率与喉癌淋巴结转移、TNM分期有关，RPL41蛋白阳性表达率与喉癌组织分化程度、TNM分期有关（P均＜0.05）。见表1。

表1 ATF4、RPL41蛋白阳性表达率与喉癌患者临床病理特征的关系［例（%）］

2.4 喉癌组织中ATF4、RPL41 蛋白表达与患者预后的关系 ATF4 蛋白表达阳性与阴性的喉癌患者5 年生存率分别为 59.34%（54/91）、79.31%（23/29），比较差异有统计学意义（P＜0.05）。RPL41 蛋白表达阳性与阴性的喉癌患者5 年生存率分别为78.13%（25/32）、59.09%（52/88），比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

喉癌是多因素、多机制共同作用的结果，细胞异常增殖、转移在喉癌的癌变、恶性进展中发挥关键作用［9-10］。寻找与喉癌细胞增殖、转移密切相关的分子靶标并用于喉癌的病理特征判断、改善患者预后具有重要意义。

研究发现，ATF4 通过增加谷氨酸转运蛋白表达，诱导肿瘤血管新生，为肿瘤细胞远端转移提供营养物质［11］；且肿瘤细胞可以借由肿瘤血管进行远端转移［12-13］。因此在喉癌组织中ATF4 蛋白表达上调能够诱导肿瘤血管新生，使肿瘤细胞得到更多的营养供给，进而实现大量增殖；同时部分高转移性的喉癌细胞能够以新生肿瘤血管为通道，随血液循环进入邻近组织或远处组织，进而发生转移。研究发现ATF4 能够激活信号转导与转录激活因子3 信号通路，进而抑制E-钙黏蛋白的表达，从而促进肿瘤转移［14］。由于E-钙黏蛋白和胶原蛋白等胞外基质蛋白具有促进细胞间黏附的作用，因此在喉癌组织中ATF4表达上调会抑制胞外基质的形成，导致喉癌细胞之间及其与正常组织细胞之间的黏着性降低，进而肿瘤细胞侵袭性增强，更易发生转移［15］。而喉癌的淋巴结转移是患者不良预后的影响因素［16］。本研究发现，喉癌组织中ATF4蛋白阳性表达率明显升高，ATF4蛋白阳性表达率在高TNM分期、有淋巴结转移的患者中明显较高，ATF4蛋白表达阳性的患者5年生存率低于表达阴性患者。分析其原因可能是由于ATF4参与肿瘤血管新生和细胞黏附蛋白表达调节。

目前肿瘤细胞死亡的机制主要包括细胞凋亡、细胞自噬，其中细胞凋亡是肿瘤细胞死亡的主要机制，细胞凋亡过程中形成大量凋亡小泡，将肿瘤细胞中的细胞器和大分子蛋白转运至溶酶体进行降解［17-18］。耿雯等［19］的研究发现，RPL41 能够促进肿瘤细胞凋亡，因此笔者推测喉癌患者RPL41 蛋白阳性表达率下降后，其促进喉癌细胞凋亡的作用明显减弱，使得喉癌细胞可以大量增殖，病灶增大，压迫患者头颈部神经、血管，最终导致患者死亡。肿瘤分化程度与肿瘤增殖能力密切相关，低分化的肿瘤细胞往往具有较强的增殖能力。RPL41能够抑制细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路，进而抑制肿瘤细胞增殖。由于ERK 信号通路是细胞周期进程的重要调节通路，其下游靶基因中的细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白B1 等细胞周期调节蛋白均参与肿瘤细胞周期进程的调节，因此推测喉癌中RPL41 表达下调会促进ERK 信号通路活化，进而促进肿瘤细胞周期进程，使得肿瘤细胞增殖能力提高。本研究发现，在喉癌组织中RPL41 蛋白阳性表达率明显下降，并且RPL41 蛋白阳性表达率在高TNM 分期、组织低分化的喉癌患者中明显降低，其表达阳性患者预后优于阴性患者。分析其原因可能是由于RPL41参与肿瘤增殖和凋亡的过程。

本研究还发现，喉癌组织中ATF4 蛋白表达与RPL41蛋白表达呈负相关。分析其原因可能是由于ATF4在喉癌中起到促癌基因的作用，而RPL41则起到抑癌基因的作用，二者在喉癌发生发展中具有一定拮抗作用。

综上所述，喉癌组织中ATF4 呈高表达，而RPL41 呈低表达，ATF4 表达与肿瘤 TNM 分期、淋巴结转移和预后相关，RPL41 表达与TNM 分期、分化程度及预后相关，二者对喉癌患者的预后评估有一定临床价值。