SIRT6 对前列腺癌细胞株增殖能力和凋亡水平的影响

裴 亮 ，王振兴 ，周儒奎 ，杨李旺 ，储开博 ，武 赟 ，翟晓艳

（1.山西医科大学第二医院泌尿外科，山西太原030001； 2.山西中医药大学基础医学系，山西晋中030619）

在世界范围内，前列腺癌发病率在男性癌症中排名第二，死亡率排名第六，严重威胁男性的生命健康，随着世界人口老龄化日益严重，发病率和死亡率会持续增长［1］。对于前列腺癌的治疗方式有手术、放射、内分泌和化学治疗等方法。对于晚期的前列腺癌患者主要以改善临床症状和延长生存期为主，基因治疗为前列腺癌的治疗提供了一个新的思路［2］。

SIRT6 属于 SIRT 家族（SIRT1-7）成员之一，主要位于细胞核异染色质中，具有NAD 依赖的组蛋白去乙酰化酶活性和ADP 核糖基转移酶活性。在遗传变异和氧化应激时具有维持基因组稳定性、碱基切除修复和DNA 双链断裂修复的作用，参与细胞的凋亡、炎症、代谢和衰老等过程［3］。

癌症以持续的细胞增殖、能量代谢改变、炎症反应为特点，被认为是一种衰老相关的疾病，SIRT6近年来被认为是一种抗衰老因子，同时对多种肿瘤具有抑制作用。有研究发现在某些肿瘤中SIRT6 的表达下降，同时SIRT6 缺失可引起糖酵解增加和肿瘤生长［3］。然而SIRT6 对前列腺癌的作用如何目前研究很少，本研究拟探讨SIRT6 对前列腺细胞增殖能力和凋亡水平的影响。

1 材料与方法

1.1 主要细胞与试剂

细胞：本实验中所用的前列腺癌细胞株（LNCAP、PC-3、DU145）和前列腺上皮细胞系（RWPE-1）均于上海中国科学院细胞库购买。

主要试剂：CCK-8 试剂盒购买于日本同仁化学研究所，Annexin V-PI 凋亡试剂盒购买于美国Invitrogen 公司，兔抗人SIRT6 多克隆抗体购买于英国 Abcam 公司，鼠抗人 β 肌动蛋白（ACTB）单克隆抗体购买于美国Santacruz 公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG 抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，高灵敏度化学发光检测试剂盒购买于上海汉恒生物科技有限公司，DUB00 型核酸蛋白分析仪购买于美国Beckman Coulter 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Western 印迹法检测细胞中SIRT6 蛋白表达 分别收集前列腺癌细胞株（LNCAP、PC-3、DU145）和前列腺上皮细胞系（RWPE-1）后，用预冷的PBS 冲洗3 次，加入RIPA 裂解液提取总蛋白，冰上孵育 30 min，期间每 10 min 混匀 1 次。4 ℃，12 000 g，离心15 min，用BCA 法检测蛋白浓度。取 30 μg 蛋白加入，经 10% SDS-PAGE 凝胶电泳后，转移至PVDF 膜上，加5%脱脂牛奶常温封闭2 h。加入一抗兔抗人 SIRT6 抗体（1∶1000）和鼠抗人 ACTB 抗体（1∶500），4 ℃过夜，TBST 清洗 3 次，加入1∶2000 辣根过氧化物酶标记的IgG 二抗，室温孵育2 h，加入显影液用图像分析系统采集图像，Image J 软件以ACTB 为参照分析相对灰度值。SIRT6 蛋白相对表达水平=SIRT6 灰度值/ACTB 灰度值。

1.2.2 SIRT6 基因转染 将前列腺癌细胞株PC-3 分为对照组和SIRT6 转染组，委托广州赛业生物科技有限公司构建过表达SIRT6 的质粒。SIRT6 转染组加入SIRT6-过表达质粒转染，使其SIRT6 的表达增高，对照组加入空质粒转染。取对数生长期的PC-3 细胞，按照1×106细胞/孔浓度接种到6 孔板中，当细胞培养至40%~50%融合度时，按照质粒转染说明书，分别加入SIRT6 过表达质粒和空白质粒后，加入Lipofectamine 2000 助染剂，转染72 h后，用Western 印迹法检测转染是否成功（方法同上）。

1.2.3 CCK-8 法检测细胞的增殖能力 将转染72 h 后的PC-3 细胞（对照组和SIRT6 转染组）制备成1×104/mL 的细胞悬液，按照100 μL/孔接种入 96孔板中，置入37 ℃，5% CO2培养箱中培养，分别在培养 0、12、24、36、48 h 后，每孔加入 10 μL CCK-8 试剂，在 37 ℃，5%CO2培养箱中孵育 2 h，在酶标仪测定450 nm 波长处的吸光值（OD450），每组细胞的每个时间点3 个复孔，取各孔平均值，绘制生长曲线。

1.2.4 Annexin V-PI 染色法检测细胞的凋亡水平将转染72 h 后的PC-3 细胞（对照组和SIRT6 转染组），采用细胞刮轻刮细胞，离心收集所有贴壁及死亡后未贴壁的细胞，PBS 清洗3 遍，调整细胞为 5×106/mL，按照说明书，取 100 μL 细胞，分别加入 5 μL 的 Annexin V 工作液和 1 μL PI 工作液，轻轻混匀后，室温避光孵育15 min，流式细胞术检测细胞凋亡水平，凋亡细胞为Annexin-V 阳性细胞。

1.3 统计学方法

使用SPSS 18.0 软件进行统计分析，实验数据均为计量资料，以均数±标准差（）表示，两组资料比较采用t-test 分析法，两组以上资料比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 SIRT6 在前列腺癌细胞中的表达

本研究采用Western 印迹法检测了3 种前列腺癌细胞株（LNCAP、PC-3、DU145）与正常前列腺上皮细胞系（RWPE-1）中SIRT6 蛋白的表达，结果发现，无论是哪种前列腺癌细胞，其SIRT6 的表达均低于正常前列腺上皮细胞（P<0.01）。其中PC-3 细胞SIRT6 表达相对较低，但3 种前列腺癌细胞SIRT6 的表达比较差异无统计学意义。本研究选择PC-3 细胞作为SIRT6 过表达的目标细胞。结果见图1。

图1 SIRT6 在3 种前列腺癌细胞中的表达

2.2 过表达SIRT6 后前列腺癌细胞的增殖能力

为了验证SIRT6 对前列腺癌细胞的作用，本研究通过质粒转染使PC-3 细胞中SIRT6 的表达升高。SIRT6 过表达后，通过CCK-8 法我们可以看到，SIRT6 转染组细胞与对照组相比，细胞培养12 h 和24 h 增殖活性比较差异无统计学意义，培养至36 h 和48 h 增殖活性下降，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见图 2、图 3。

图2 转染后PC-3 细胞中SIRT6 的表达量

图3 SIRT6 过表达后PC-3 细胞增殖活性的改变

2.3 过表达SIRT6 后前列腺癌细胞的凋亡水平

PC-3 细胞过表达SIRT6 后，通过Annexin V-PI 双染检测细胞的凋亡率，结果发现对照组细胞的凋亡率为（5.72±1.28）%，SIRT6 转染组细胞的凋亡率为（12.45±2.35）%，SIRT6 转染组细胞的凋亡率显著高于对照组细胞，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见图4。

图4 SIRT6 过表达后PC-3 细胞凋亡水平的改变

3 讨 论

肿瘤细胞与正常细胞最主要的区别就是细胞的无限增殖能力，为了满足细胞生长的能量需求，肿瘤细胞的代谢与正常细胞有所不同，这种不同主要表现为糖代谢异常：肿瘤细胞即使在有氧条件下也优先进行糖酵解，因此可以增加葡萄糖摄入量，肿瘤细胞与普通细胞在糖代谢上的差别被称为“瓦博格效应”。SIRT6 在代谢方面参与葡萄糖的代谢，SIRT6 基因敲除使小鼠肌肉和棕色脂肪组织对葡萄糖的摄入大幅增加，出现严重的低血糖［3-4］；SIRT6 基因敲除后，引起细胞膜上葡萄糖载体-1 表达增加，小鼠葡萄糖摄入增加，糖酵解增加，同时线粒体呼吸收也受到抑制［5-6］。综上所述，SIRT6 敲除后，小鼠体内葡萄糖代谢与肿瘤细胞的代谢方式一致。因此，SIRT6 可能是一个肿瘤抑制因子。

为了证明SIRT6 的表达与前列腺癌有关，本研究首先比较了3 种前列腺癌细胞与正常前列腺上皮细胞中SIRT6 的表达，结果发现SIRT6 在前列腺癌细胞中的表达较正常前列腺上皮细胞降低，这与本研究的假设一致。

为了进一步证实SIRT6 在前列腺癌细胞中表达的差异与其细胞的功能有关，本研究在前列腺癌细胞过表达SIRT6 后，观察其增殖能力和凋亡水平的变化，结果证实过表达SIRT6 后，前列腺癌细胞的增殖能力下降，同时前列腺癌细胞的凋亡水平升高。提示SIRT6 参与前列腺癌细胞增殖和凋亡，可能是治疗前列腺癌的一个有效靶点。

Sebastian C 等［7］研究发现：SIRT6 缺失后，小鼠胚胎成纤维细胞的增殖能力提高，注射入小鼠体内可成瘤，不仅如此，还增加细胞的葡萄糖摄入量，糖酵解相关的基因表达增高。抑制糖酵解后，SIRT6 缺失的小鼠胚胎成纤维细胞其成瘤性也受到抑制，因此，SIRT6 可能通过抑制癌细胞的有氧糖酵解从而达到抑制肿瘤生长的目的［7］。SIRT6 在多种肿瘤都有抑制肿瘤细胞生长的作用［3］，但是，SIRT6 对前列腺癌细胞的作用机制是否也是通过抑制糖酵解来完成的，其中哪些通路参与了抑制糖酵解的过程，这些都有待后续的研究进一步去证实和探索。