富硒菊芋多糖的提取及其体外抗氧化活性研究

2021-11-15许丹丹徐雅琴周守标汪昌保

中国农学通报 2021年30期

许丹丹，徐雅琴，隽行，周守标，汪昌保，杭华

（1安徽师范大学生态与环境学院，安徽芜湖 241000；2安徽师范大学生命科学学院，安徽芜湖 241000）

0 引言

菊芋(Jerusalemartichoke)是多年宿根性草本植物，又称洋姜，鬼子姜[1]。菊芋被称为“21世纪人畜共用作物”，在医疗保健、生态环境改善以及功能食品开发等方面有着重要作用[2]。菊糖具有肠道益生素、促进矿物质吸收、抗氧化、预防骨质疏松、调节血糖血脂、调节免疫、抗癌等生理功能[3-4]，其已经成为功能性食品的研究热点。硒(Selenium)作为人体生命必需的微量元素[5]，其是谷胱甘肽过氧化物酶不可缺少的组成部分。谷胱甘肽过氧化物酶是稳定生物膜的必需成分和体内自由基的捕获剂；其与VE协同地保护细胞免受脂质过氧化损伤，防止生成脂褐素，抗衰老，抑癌抗癌和解除重金属中毒等作用[6]。

近年来，富硒产品日益增多，尤其是富硒农产品及其硒多糖提取也是研究热点[7]。植物富硒已经成为农产品功能化与深加工的研究热点，其产品开发利用也具有较大的发展空间和经济效益[8]。在植物体中，硒多糖是植物体对无机硒进行有机化的主要作用方式。与无机硒相比，有机硒更易被机体吸收和利用，且安全性较高[9]。硒多糖作为有机硒的一种，天然获得产量很低，不能满足需求，通过化学合成的硒多糖，既可保持多糖的基本构型和生理功能，又能有效的提高硒的生物利用度，发挥微量元素硒和多糖的双重功能[10]。杨铭等[11]从富硒植物中提取纯化硒多糖，并对其与硒的结合状态进行研究。Liu X[12]等证明紫花苜蓿硒多糖比天然多糖有更强的抗氧化活性。邓正春等[13]研究表明菊芋具有较好的富硒能力。

植物多糖的提取方法有微波辅助法、超高压提取技术、酶提取法、超声辅助法、超临界流体萃取法、双水相萃取[14]。本研究采用超声辅助法[15]，利用响应面法对富硒菊芋多糖的提取条件进行优化。前期实验中表明菊芋多糖具有抗氧化性，而富硒菊芋多糖的抗氧化活性有待进一步研究。本研究拟采用亚硒酸钠对菊芋进行富硒种植，以富硒菊芋为试材，对其提取条件及抗氧化活性进行研究，以期为富硒菊芋多糖的进一步开发和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

富硒菊芋（对菊芋幼苗拌料施硒，种植获得富硒菊芋）、普通菊糖、葡萄糖标准样品、硒标品、亚硒酸钠、苯酚、浓硫酸、三羟基氨基甲烷(Tris)、邻苯三酚、浓硝酸、高氯酸、过氧化氢(30%)、铁氰化钾、盐酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine,DPPH)、无水乙醇、Vc、硫酸亚铁等均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计购于上海佑科仪器仪表有限公司；旋转蒸发仪RE-52AA9购于上海亚荣生化仪器厂；KH3200E型超声波清洗器购于昆山禾创超声仪器有限公司；DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱购于上海市三发科学仪器有限公司；HH-S恒温水浴锅购于国胜实验仪器厂；SHZ-D(Ш)循环水式真空泵购于上海凌科实业发展有限公司；TG16-WS台式高速离心机购于长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菊芋富硒在江苏宿迁附近区域采集50份菊芋生长地区的适宜土壤和50份菊芋，采集后立即密封贮藏。菊芋播种育苗，播种深度10～20 cm，播后30天左右出苗。

实验：将生长一致的菊芋幼苗分别移入1.5 kg的塑料花盆中，试验设1个空白对照，并设5个试验样，用亚硒酸钠进行施硒处理，硒含量分别为15、25、50、75、100 mg/kg，随机区组排列且设置3个重复，存放于安徽师范大学实验室中。施硒150天收获。供试土壤理化性质为pH 6.56，其余指标均符合正常生长状态。

1.3.2 富硒菊芋多糖的提取工艺见图1。

图1 富硒菊糖的提取工艺流程

1.3.3 除蛋白采用sevage法除蛋白[16]。

1.3.4 硒含量采用氢化物-原子荧光光谱法[17]测定硒含量。

1.3.5 多糖含量采用苯酚-硫酸法测定总糖含量，以葡萄糖的质量浓度和吸光度值为坐标绘制标准曲线[18]，得回归方程：y=8.28x+0.1151，R2=0.9990。根据标准曲线计算多糖提取率，见公式(1)。

式中：M0为硒多糖提取量(g)；M1为富硒菊芋原料用量(g)。

1.3.6 多糖提取单因素试验以富硒菊芋粉末为原料，分别研究超声温度、超声时间、超声功率以及液料比对硒多糖提取率的影响。各因素水平为：超声温度45、50、55、60、65、70、75℃；超声时间50、55、60、65、70、75、80 min；超声功率250、300、350、400、450、500、550 W；液料比5:1、25:1、45:1、65:1、85:1(mL/g)。

1.3.7 富硒菊芋多糖提取条件响应面优化选择超声时间、超声功率、液料比3个因素，选用Box-Behnken模型[19]进行响应面设计，以多糖提取率为响应值进行优化。试验设计因素与水平见表1，重复3次，结果取平均值。

表1 Box-Behnken试验因素与水平

1.3.8 富硒菊芋多糖抗氧化活性研究以多糖清除·OH、DPPH、O2-·的能力为指标，对利用超声提取的富硒菊糖与普通菊糖进行体外抗氧化活性比较分析。

（1）对·OH的清除活性的检测

①供试溶液的制备：分别配制浓度为10 mg/mL的Se-Inulin和Inulin水溶液，并依次稀释得到浓度为2、4、6、8、10 mg/mL待测样品液，配制同浓度的Vc水溶液；配制10 mmol/L FeSO4和10 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液以及8.8 mmol/L H2O2溶液。

②样品对·OH清除活性的检测：依据Fenton反应体系中，Fe2+和H2O2反应生成的·OH可与水杨酸反应，可用比色法于510 nm处测定·OH含量[20]。实验设样品组、空白组和对照组。实验步骤参考何钢等[21]的实验，根据公式(2)计算清除率I。

式中：A空白是空白组的吸光度值；A样品是样品组的吸光度值；A对照是对照组的吸光度值。

（2）对DPPH清除能力的测定[22]

①供试溶液的制备：分别配制浓度为10 mg/mL的Se-Inulin和Inulin水溶液，并依次稀释得浓度为2、4、6、8、10 mg/mL待测样品液，配制同浓度的Vc水溶液；配制0.1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液。

②样品对DPPH清除活性的检测：取3个试管，分别加入1.5 mL DPPH与1.5 mL水、1.5 mL无水乙醇与1.5 mL多糖溶液、1.5 mL DPPH与1.5 mL多糖溶液，分别设为空白组，对照组和样品组。根据DPPH具有单电子而使其在517 nm处有一强吸收呈深紫色，当存在自由基清除剂时，清除剂与单电子配对而使其吸收逐渐消失，而褪色程度与其所接受的电子数成定量关系这一原理[23]，测定样品液对DPPH的清除活性。并按照公式(2)计算清除率I。

（3）对O2-·清除能力的测定

①供试溶液的制备：分别配制浓度为10 mg/mL的Se-Inulin和Inulin水溶液，并依次稀释得浓度为2、4、6、8、10 mg/mL待测样品液，配制同浓度的Vc水溶液；配制pH 8.2 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液；3 mmol/L邻苯三酚溶液（用10 mmol/L HCl溶液配制）。

②样品对O2-·清除活性的检测：采用邻苯三酚自氧化法，实验设样品组、空白组。样品组加入1 mL不同浓度的多糖提取液（浓度分别为2、4、6、8、10 mg/mL），实验步骤参考张晓艳等[24]的实验，按照公式(3)计算清除率I。

式中：ΔA空白为线性范围内空白组吸光度的增加值；ΔA样品为线性范围内样品组吸光度的增加值。

1.4 数据处理

采用 Origin(Version8.5)和 DesignExpert(Version8.0.4)作图，采用SPSS(Version 17.0)进行统计学分析，显著性检验采用最小显著差数法。

2 结果与分析

2.1 土壤含硒量对菊芋块茎含硒量的影响

由表2可知，在对土壤进行施硒的浓度范围内，施硒80天后，菊芋块茎的硒含量在0.003～7.132 mg/kg之间。菊芋盆栽土壤施硒后，随着施硒量的增加，其含硒量与之呈极显著的正相关，且施硒组显著高于空白组。方差分析表明：菊芋块茎的含硒量在各处理组之间均呈现显著性差异(P＜0.05)；在对土壤进行施硒浓度的范围内，盆栽土壤施硒150天后，菊芋块茎的含硒量在0.121～8.563 mg/kg之间。同样，随着施硒量的增加，其含硒量与之呈极显著的正相关，且施硒组显著高于空白组。方差分析表明：菊芋块茎的含硒量在各处理组之间均呈现显著性差异(P＜0.05)。在盆栽土壤施硒范围内，菊芋能够主动吸收土壤中的硒并富集在其块茎处，其硒含量最高可达到8.563 mg/kg。

表2 盆栽土壤施硒对菊芋硒积累量的影响

2.2 多糖含量的测定

制作的标准曲线回归方程y=8.28x+0.01151，R2=0.9990。经试验测定富硒菊芋多糖与对照样品的OD值分别为1.253、0.943，计算多糖得率分别为13.68%、9.99%。

2.3 单因素试验结果

由图2(a)-(d)可知，超声时间为60 min，超声温度为65℃，超声功率为450 W、每克样品加液量25 mL为适宜提取条件。由SPSS 17.0软件进行单因素方差分析得知，除超声温度对提取率影响不显著外(P＞0.05)，其余各因素对多糖的提取率均存在极显著的影响(P＜0.01)。单因素试验结果表明，当超声时间、超声功率超过其适宜条件后，多糖提取率分别呈现不同程度的下降，这可能是由于过长的超声波机械作用和热效应或过长/强的微波强热效应，使部分硒多糖发生降解造成的[25]。

图2 超声时间(min)(a)、超声温度(℃)(b)、超声功率(W)(c)、每克样品加液量(mL)(d)对富硒菊糖提取率的影响

2.4 响应面优化试验

2.4.1 响应面优化试验结果根据单因素试验结果，选取超声时间、超声功率及液料比3个因素，采用三因素三水平进行响应面设计，实验方案及结果见表3。

表3 Box-Behnken试验设计与结果

2.4.2 回归方程的建立与显著性检验利用SPSS(Version 17.0)软件，通过对多项式回归分析，得到的拟合全变量二次回归方程模型为：Y=13.71+0.048A+0.015B-0.91C-0.22AB+0.25AC+0.14BC-1.17A2-0.49B2-1.07C2。该模型的模拟方差分析结果见表4。由表4可知，该模型P＜0.0001，表明回归模型高度显著；失拟项P=0.9676＞0.05，模型失拟不显著，实验误差小；模型相关系数R2=0.9984，校正决定系数R2Adj=0.9969，表明此模型拟合优度好，因此可用该模型来分析和预测富硒菊芋多糖提取工艺。此外，液料比及模型各交互项对试验结果影响较大。

表4 回归模型方差分析

2.4.3 响应面各因素交互作用分析以超声时间A、超声功率B、液料比C这3个影响多糖得率的因素两两组合作为自变量，以多糖得率为相应指标绘制响应面，用来评价各因素两两组合对提取得率的交互影响作用，如图3所示，AB、AC响应曲面坡度陡峭，交互作用高度显著，BC响应面相对陡峭，交互作用显著。3个因素中液料比对多糖提取率影响最大，随着液料比的增大，硒多糖提取率亦快速上升。

图3 两因素交互作用对富硒菊糖提取率影响的响应面分析

2.5 富硒菊芋多糖抗氧化活性的测定结果

2.5.1 对羟基自由基清除作用的评价由图4可以看出，在实验浓度范围内，Se-Inulin和Inulin对羟基自由基的清除作用呈现出较好的量效关系，且随着多糖质量浓度的升高而不断增强。在最高浓度10 mg/mL时，Se-Inulin和Inulin对羟基自由基的清除率分别达到了80.34%、62.1%，且实验整体来看，Se-Inulin的清除效率始终大于Inulin。在质量浓度为6 mg/mL时，Inulin对羟基自由基的清除趋势平缓，而Se-Inulin的清除能率不受影响，说明硒与多糖的结合增强了多糖的抗羟基自由基能力。

图4 Se-Inulin、Inulin和Vc对·OH自由基清除活性

2.5.2 对DPPH的清除能力的评价由图5可以看出，在实验浓度范围内，Se-Inulin和Inulin对DPPH的清除作用呈现出较好的量效关系，且随着多糖质量浓度的升高而不断增强，在最高浓度10 mg/mL时，Se-Inulin和Inulin的清除率均达到89.19%、77.23%，由此可说明Se-Inulin和Inulin均具有一定的抗氧化活性。此时Se-Inulin的最大抑制浓度接近于Vc的清除率，证明其有良好的清除DPPH活性的能力。在抗氧化物浓度递增过程中，Se-Inulin的清除率均大于Inulin，而且其变化趋势非常接近，一定程度上说明了Se-Inulin中的硒元素在清除DPPH的过程中发挥了重要的作用。在质量浓度为6 mg/mL时，同羟基自由基清除率趋势相同。

图5 Se-Inulin、Inulin和Vc对DPPH清除活性

2.5.3 对超氧自由基的清除能力的评价由图6可以看出，在实验浓度2～10 mg/mL浓度范围内，Se-Inulin和Inulin对超氧自由基清除率均呈现良好的量效关系，在最高浓度10 mg/mL时，Se-Inulin和Inulin对超氧自由基的清除率十分接近，分别为88.54%、81.82%。同时在整个实验浓度过程中，Se-Inulin对超氧自由基的清除率均大于Inulin。在质量浓度为6 mg/mL时，同DPPH清除率和超氧自由基清除率趋势相同。

图6 Se-Inulin、Inulin和Vc对O2-·自由基清除活性

3 结论与讨论

3.1 结论

菊芋富硒的硒含量最高可达到8.563 mg/kg；响应面优化超声提取菊芋硒多糖最佳工艺条件（超声时间60 min、超声功率450 W、液料比为25:1），提取率达到(13.52%)；通过对比Se-Inulin和Inulin对羟基自由基、DPPH、超氧自由基的清除活性的研究，Se-Inulin对自由基具有更好的清除作用。