胶霉毒素菌渣的抗菌活性及其应用的研究

韩立霞，魏圣可，冯文娟

（1黄河三角洲京博化工研究院有限公司，山东滨州 256500;2山东京博控股集团有限公司，山东滨州 256500）

0 引言

胶霉毒素菌渣是木霉在液体或固体培养基上发酵后经有机溶剂提取胶霉毒素后留下的固体物质，是胶霉毒素发酵过程中产生的一种废弃物，其主要成分是木霉菌丝体及未利用完的培养基成分。胶霉毒素菌渣长期堆置会发生二次发酵，使其保存非常困难，而且还会产生恶臭味，污染环境，从而限制了它的下一步应用。因此，如何解决菌渣的再利用成为木霉发酵过程中必须解决的问题。土传病害是中国目前农业生产中的主要病害之一，会导致作物减产，甚至绝收。目前，国内外对胶霉毒素在真菌和病毒抑制作用的研究较多[1-2]，而胶霉毒素菌渣对土传病菌的抑菌研究和应用报道较少。Weindling and Emerson 1936年首次将胶霉毒素从Trichodermalignorum中分离出来[3]，后来越来越多的研究人员对胶霉毒素在抗菌[4-5]、抗病毒[6]、抗肿瘤[7]、诱导细胞凋亡和调节免疫力等作用及作用机理[8-9]进行了一系列研究，以及木霉或胶霉毒素对土传病的防治研究[10-11]。本实验室为了开发一种高效的生物农药，对绿色木霉发酵培养基优化和高产胶霉毒素菌株的筛选等开展大量的工作[12-13]，在产业化生产过程中，产生了大量的菌渣有待处理。为了解决木霉发酵完成后的菌渣处理问题，开展了胶霉毒素菌渣对5种土传病菌的抗菌效果的研究，并把菌渣作为氮源再次利用来发酵木霉，希望开拓胶霉毒素菌渣在生物有机肥领域的应用，提高经济效益，实现菌渣的循环利用和资源的可持续发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干菌渣：取经板框过滤后的胶霉毒素菌渣，55℃烘干，含水量为7%，粉碎后过20目筛备用。

受试菌株：辣椒炭疽病菌、水稻纹枯病菌、油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌、苹果腐烂病菌，滨州学院提供。绿色木霉(Trichodermaviride)：菌株代码为JBSH-002，保藏号为CGMCC，本公司提供。

1.2 仪器与设备

液相色谱仪：LC-20AT，日本岛津公司。超净工作台：W-CJ-1D型，苏州净化设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅：LDZX-50KBS，上海申安医疗器械厂；摇床：HZQ-R，常州诺基仪器有限公司；生化培养箱：250B，金坛市中大仪器厂；高速中药粉碎机：YF系列，江阴伟翔机械制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 培养基的配制 PDA培养基：去皮土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂16 g，蒸馏水1000 mL。土豆去皮后切成小块加入蒸馏水中煮沸20 min，用4层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖和细菌琼脂，边加热边搅拌，溶解后冷却至室温，补充蒸馏水至1000 mL，混匀后分装到4个500 mL的三角瓶中，棉塞封口后置于灭菌锅中121℃灭菌20 min。

木霉种子培养基：葡萄糖20 g/L、土豆汁200 g/L。

木霉固体培养基：设空白对照组、阳性对照组、实验组，空白对照组添加70 g棉籽壳和30 g玉米粉；阳性对照组添加10 g豆粕、60 g棉籽壳和30 g玉米粉；实验组添加10 g菌渣、60 g棉籽壳和30 g玉米粉。

1.3.2 真菌的活化 将辣椒炭疽病菌、水稻纹枯病菌、苹果腐烂病菌、油菜菌核病菌和棉花枯萎病菌5种真菌分别从试管中转接到PDA培养基平板上，28℃培养箱中培养4～5天，备用。

1.3.3 菌渣平板的制备 分别称取0、2、5、10 g菌渣于小烧杯中，加入10 mL 75%的乙醇混匀，封口膜封口，在超净工作台上放置10 min。将灭好菌的菌渣分别加入到50℃的250 mL培养基中，混匀，制成菌渣含量为0、8、20、40 mg/mL的平板，备用。

1.3.4 菌渣对菌丝生长的影响 用打孔器在5种真菌菌落边缘打取6 mm的菌饼，将菌饼接种到菌渣平皿（直径9 cm）的中央，菌饼面朝上，每皿1片，每个处理重复3次，用透气封口膜封好后置于25℃培养箱中连续培养7天，用十字交叉法从3天后开始测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。

1.3.5 木霉种子培养 用接种铲从斜面试管中挖一块木霉种子转入装液量200 mL的500 mL种子瓶，置于转速为200 r/min的摇床28℃振荡培养2天。

1.3.6 木霉固体发酵培养 将已经培养好的种子液转接到固体发酵瓶中，接种量20%，培养温度28℃，培养5天。

1.3.7 木霉孢子计数 取1 g（干重）固体培养基于100 mL 0.85%的氯化钠溶液中，振荡1 h，取1 mL加入到9 mL无菌水中，依次稀释5个梯度，取第4、5支管100 μL均匀涂在含0.1%脱氧胆酸钠的PDA培养基上，28℃下培养36 h后计数。

1.3.8 蛋白质的测定 采用凯氏定氮法。

1.3.9 胶霉毒素的测定 采用HPLC法，取20 g固体发酵培养基于三角瓶中，加入100 mL乙酸乙酯振荡40 min，离心，取5 mL上层萃取液旋蒸干，加入1 mL甲醇溶解后过0.2 μm的有机膜后进行高效液相色谱分析。

色谱条件：洗脱液：甲醇:水=50:50，检测波长：254nm，柱温：30℃，流速：l.0 mL/min，进样量：20 μL，色谱柱：Hypersil BDS C18柱(200 mm×4.0 mm，5 μm)。

2 结果与分析

2.1 菌渣成分分析

经凯氏定氮法测定干菌渣中蛋白质含量为21.32%，经高效液相色谱法测定干菌渣中胶霉毒素含量为1.87 mg/g。

2.2 菌渣对土传病菌菌丝生长的影响

由表1可以得到，8 mg/mL的菌渣对辣椒炭疽病菌菌丝的生长无抑制作用，20、40 mg/mL的菌渣对辣椒炭疽病菌菌丝的生长均有抑制效果，其中40 mg/mL的菌渣的抑制效果最好，达到35%以上。

表1 胶霉毒素菌渣对辣椒炭疽病菌菌丝的影响

由表2可以得到，8、20、40 mg/mL的菌渣对水稻纹枯病菌菌丝的生长均有抑制效果，其中40 mg/mL的菌渣对水稻纹枯病菌菌丝的生长的抑制率达到100%。

表2 胶霉毒素菌渣对水稻纹枯病菌菌丝的影响

由表3可以得到，8、20 mg/mL的菌渣对苹果腐烂菌菌丝的生长无抑制作用，40 mg/mL的菌渣对其抑制率达到100%。

表3 胶霉毒素菌渣对苹果腐烂菌菌丝的影响

由表4可以得到，8 mg/mL的菌渣对油菜菌核病菌的抑制率在70%以上，20、40 mg/mL的菌渣对其抑制率达到100%。

表4 胶霉毒素菌渣对油菜菌核病菌菌丝的影响

由表5可以得到，8、20 mg/mL的菌渣对棉花枯萎病菌菌丝的生长的抑制效果无显著性差异，40 mg/mL的菌渣对其抑制率达到100%。

表5 胶霉毒素菌渣对棉花枯萎病菌菌丝的影响

综上所述，胶霉毒素菌渣对辣椒炭疽病菌、水稻纹枯病菌、苹果腐烂病菌、油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌具有一定的抑制效果。胶霉毒素菌渣的浓度不同，抑菌效果不同，浓度越大，抑菌效果越好。同浓度的胶霉毒素菌渣对这5种土传病菌的抑菌效果不同。胶霉毒素菌渣之所以具有抑菌效果，可能与胶霉毒素菌渣中含有少量的胶霉毒素残留有关。

2.3 菌渣对木霉生长和胶霉毒素含量的影响

胶霉毒素菌渣中少量的胶霉毒素残留为木霉的代谢产物，对木霉的生长无抑制作用，因此，考虑将菌渣作为氮源培养绿色木霉。从表6可以看出，与空白对照组相比，添加菌渣的培养基培养木霉得到的干重孢子数和产生的胶霉毒素显著增多；与阳性对照组相比，添加菌渣的培养基培养木霉得到的干重孢子数和产生的胶霉毒素含量无显著差异。因此，胶霉毒素菌渣可以作为氮源用于木霉的培养。

表6 胶霉毒素菌渣对木霉孢子和胶霉毒素含量的影响

2.4 不同菌渣添加量对木霉孢子的影响

菌渣、棉籽壳、玉米粉的总量保持一致，在改变菌渣添加量的同时，增加棉籽壳和玉米粉的添加，棉籽壳和玉米粉添加比例2:1保持不变。

由图1可以得到，木霉固体培养中菌渣添加量不同，培养7天后干重孢子数存在差异，其中菌渣添加量30%时，干重孢子数最多；当菌渣添加量高于30%时，随着菌渣添加量的增加，干重孢子数呈下降趋势。可能是菌渣是培养基经过木霉发酵之后的残渣，木霉发酵过程中分泌大量的胞外降解酶类，破坏培养基的结构，使得蛋白质和糖类更易利用[14]。

图1 菌渣添加量对木霉孢子的影响

3 讨论

菌丝生长速率法[15-16]是将供试药剂与培养基混合，根据菌落的生长速度来评价供试药剂的毒性大小，该方法是农药生物测定最常用的方法之一。但是，由于不同微生物的菌丝生长速度不同，尽量每天对菌丝进行测量，以免菌丝生长速度过快，因测量不及时而影响实验结果。

目前，食用菌菌渣[17-18]、酱醋渣[19-20]的综合利用的研究较多，而胶霉毒素菌渣的综合利用报道较少。但是，胶霉毒素生产过程中产生大量的菌渣，即木霉菌丝体、未利用完的培养基、各种代谢产物、残留的有机溶剂等，每生产1 t胶霉毒素约产生10 t的菌渣，不仅污染环境还造成严重的资源浪费。本论文研究发现胶霉毒素菌渣对辣椒炭疽病菌、水稻纹枯病菌、油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌、苹果腐烂病菌均有一定的抑制效果，开辟了一种胶霉毒素菌渣利用途径。

由于胶霉毒素菌渣中含有胶霉毒素和有机溶剂残留，且蛋白质含量较高，因此，将胶霉毒素菌渣作为培养基或生物肥料循环再利用是一种很好的选择。同时，也是因为胶霉毒素菌渣中含有胶霉毒素和有机溶剂残留，限制了其在饲料方面的应用，今后如果想要将胶霉毒素菌渣应用于饲料方向，需要寻找一种去除胶霉毒素和有机溶剂残留的即有效又安全的方法。

4 结论

胶霉毒素菌渣对5种土传病菌均有一定的抑制效果，菌渣浓度越大，抑菌效果越好。培养基中添加胶霉毒素菌渣对辣椒炭疽病菌、水稻纹枯病菌、油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌、苹果腐烂病菌培养7天后，40 mg/mL的胶霉毒素菌渣能够完全抑制水稻纹枯病菌、油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌和苹果腐烂病菌的生长，对辣椒炭疽病菌的抑制效果不明显，抑制率仅为39.02%。

胶霉毒素菌渣作为氮源培养绿色木霉，菌渣添加量为30%时，木霉干重孢子数达到22亿/g，发酵水平比空白对照组提高了7.24倍。